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【摘要】 目的: 为保证食品安全，建立了一套检测食品中非食用色素酸性橙II的方法。 方法: 以甲醇-0.02mo1/L醋酸铵水溶液为流动相，梯度洗脱，在484nm用紫外检测器进行检测。 结果: 其重复测定结果的相对偏差为5.91%，回收率在91.75%～104.20%范围内。 结论 :本方法适用于食品中合成色素与非食用色素酸性橙II的同时测定。
【关键词】 非食用色素;酸性橙II;测定方法;HPLC
HPLC method for the determination of Inedible pigment acid orange II in foods
【Abstract】 0bjective:A rapid method using a reverse-phase high performance liquid chromatography for the determination of Acid Orange II in foods was presented。 Methods: It was flow is methanol-acetic acid ammonium，it was used as the mobile phase at a velocity of gradient。The eluate was detected by a UV detector at484nm。 Results: The variation coefficient was5.91%and the recovery of Acid Orange II was91.75%～104.20%。 Conclusions: This method was suitable for the determination of pigment and Inedible pigment Acid Orange II in foods。
【Key words】 Inedible pigment;Acid orange II;Quantitative analysis;High performance liquid chromatography
非食用色素酸性橙II又名金橙II、二号橙、桔黄橙、酸性金黄II或酸性艳橙GR，俗名金黄粉，化学名为2-萘酚偶氮对苯磺酸钠，是一种酸碱指示剂。医学上用于组织切片染色，在纺织上用作着色剂。酸性橙II属非食用色素，食品中不允许加入。但是由于酸性橙II色泽鲜艳、着色稳定、价廉等特点，一些不法商贩为了牟取暴利将其用于食品生产与加工，严重危害了消费者身体健康。因此，及时准确判断食品中是否存在该非食用色素，建立一套快速、准确的食品中非食用色素酸性橙II的测定方法具有重要意义。
据国内文献报道，酸性橙II的测定方法有纸层析法和分光光度法等 ［1，2］ ，这些方法操作时间长，定量精度差。我们经过大量实验摸索，建立了高效液相色谱（HPLC）法测定食品中酸性橙II的方法，本方法快速、准确，适用于食品中合成食用色素与非食用色素酸性橙II的同时测定。
1 材料与方法
1.1 原理 食品中非食用色素酸性橙II经提取制成水溶液，注入高效液相色谱仪，经反相色谱分离，根据保留时间定性，采用外标法进行定量。
1.2 仪器 高效液相色谱仪:Waters515泵，Waters紫外可见波长检测器，KQ-100DB型数控超声波清洗器，离心机。
1.3 试剂 重蒸馏水、乙酸、甲醇（色谱纯）、聚酰胺粉（过200目筛）、乙酸铵溶液（0.02mol/L）、柠檬酸溶液、无水乙醇-氨水-水溶液。酸性橙II:美国Aldrich公司;柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄:国家标准物质中心。
酸性橙II标准溶液:准确称取干燥的酸性橙标样0.1000g，蒸馏水溶解，定容至100ml，此溶液1ml含1.00mg酸性橙II。临用时，用蒸馏水稀释至1ml含10mg的酸性橙II标准使用液。
混合着色剂标准溶液:准确称取按其纯度折算为100%质量的柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、酸性橙II各0.100g，置100ml容量瓶中，加pH6水到刻度，配成水溶液（1.00mg/ml），临用时，用水稀释经0.45μm滤膜过滤，配成每毫升含各种标准物质10μg的混合着色剂标准使用液。
1.4 分析步骤 高效液相色谱参考条件:色谱柱:Diamonsil TM （钻石）C 18 5μm，200mm×4.6mm色谱柱（迪马公司产品）;流动相:甲醇（A）:0.02mol/L醋酸铵（B）;流速:1.0ml/min，梯度洗脱如表1所示;进样量:20μl;柱温:室温;紫外可变波长检测器:λ=484nm。
表1 梯度洗脱时间（略）
1.5 试样制备及测定
1.5.1 液体样品 饮料实验前，对于含二氧化碳试样应预先加热驱除二氧化碳;配制酒类加热驱逐乙醇，可不经稀释，过0.45μm滤膜后测定。
1.5.2 固体样品 糕点类、卤制品类、灌制品类、辣椒面等样品，称样5.00～10.00g，粉碎混匀，加无水乙醇-氨水-水（70+1+29）溶液20ml，振摇0.5h，过滤，洗滤渣2次，合并滤液，用水（pH=6）定容，过0.45μm滤膜测定。
1.5.3 奶制品 可称量5.00g试样，按GB5009.23-2003聚酰胺吸附法提取色素 ［3］ ，经0.45μm滤膜过滤测定。
2 结果与讨论
2.1 色谱条件对测定的影响 实验表明，酸性橙II在波长484nm测定，样品中常见的苯甲酸、山梨酸、糖精钠、咖啡因、维生素C、乙酸、柠檬酸等（1mg/ml）在可见波长下无响应，不干扰测定。
2.2 流动相的选择 采用甲醇+醋酸铵体系作流动相，试剂价格便宜、易得，采用梯度洗脱可以同时测定柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄。
2.3 线性范围 对酸性橙II在0.00～200μg/ml的范围内配制标准溶液系列9个点，每标样进3针，以标样的峰面积的平均值为纵坐标，以标样的浓度为横坐标，绘制标准曲线，并利用最小二阶乘法进行线性回归，得到在0.00～100μg/ml范围内的线性方程为:A=85339.63C+105139.37，相关系数r=0.9997，酸性橙II的检出限为0.05μg。柠檬黄、苋菜红、胭脂红及日落黄在0.00～50μg/ml范围内的线性方程分别为:A=74329.36C+5351.26，相关系数r=0.9987;A=85428.98C+125212.42，相关系数r=0.9982;A=85268.23C+112145.94，相关系数r=0.990;A=929123.47C+152372.68，相关系数r=0.9972。
2.4 精密度 将酸性橙II试样（卤鸡爪）溶液应用本方法分别连续进样8次（n=8），结果见表2。
由表2可以看出此方法精密度高，其变异系数为5.91%。
表2－表4 （略）
2.6 检出限 进样量10.0μl，酸性橙II的最小检出量为0.10μg，结果相对允许偏差<10%。
3 实际样品的测定
采用上述方法，对市售卤制品、饮料、灌肠类等48份试样进行测定，检出酸性橙II试样1份（卤制鸡爪），含量为0.0045g/kg。
4 小结
酸性橙II属化工染料，在食品中禁止使用，不法商贩对酸性橙II的滥用，无疑对食品卫生监督、执法提出了新的课题。本方法分离效果好，灵敏度高，能满足食品卫生学评价的要求，具有较强的使用价值。
参考文献
［1］陈大义.纸层析定性示波极谱法测定非食用色素酸性橙［J］.中国卫生检验杂志，2001，2:170-171.
［2］雷波.分光光度法对混合染料浓度的同时测定［J］.染整技术，2003，3:35-37.
［3］GB/T5009.35-2003.食品中合成着色剂的测定方法［S］.
（黑龙江省疾病预防控制中心，黑龙江 哈尔滨 150036）