帕金森病模型大鼠经颅磁刺激运动诱发电位潜伏期和中枢传导时间的研究

【摘要】  目的：探讨帕金森病(ＰＤ)模型大鼠经颅磁刺激运动诱发电位潜伏期cortical latency (CL)和中枢传导时间central conduction time (CCT)。方法：健康Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠40只，随机分为2组：①实验组（PD模型组）28只，②对照组（生理盐水组）12只，选取右侧黑质致密部（substantia nigra pars compacta,SNc）与中脑腹侧背盖（ventra tegmental area,VTA）为手术靶点，实验组注射6－羟基多巴胺(6-OHDA)制备帕金森病动物模型，对照组注射同等剂量的生理盐水，于制模前、制模后1周、3周分别行双下肢CL、 CCT检查。结果统计采用SPSS 11.5统计软件处理， P<0.05为差异有显著性。结果：术后1周，左下肢CL、 CCT实验组较对照组降低，具统计学意义（P<0.05），实验组自身左右侧TMS-MEP比较，左下肢CL、 CCT较右下肢降低（p<0.05）；制模前、术后1周、术后3周实验组大鼠左下肢CL、 CCT进行性降低（P<0.01）；实验组大鼠右下肢及对照组大鼠左侧及右侧下肢CL、 CCT无显著性差异(P>0.05)。结论：PD模型大鼠损毁侧皮层兴奋性增加，PD模型大鼠病情越重、病程越长，CL、 CCT缩短越明显。

【关键词】  帕金森病模型 大鼠 经颅磁刺激 运动诱发电位 潜伏期 中枢传导时间

    The study of Cortical threshold of Motor evoked potentials by transcranial

    magnetic stimulation for model rats of Parkinson's disease

    SUN Li-jun，HE Juan

    (The Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical College, Inner Mongolia 010050, China)

    【Abstract】  Objective：The aim of the research is to make clear if PD has Cortical threshold of TMS-MEP abnormality and if Cortical threshold changes with the developing state of an illness. Methods:Rats were randomly assigned into either experimental group (n=28) or control group (n=12), select the operated target in right substantia nigra pars compacta (SNc) and right ventra tegmental area (VTA). SNc and VTA were injected each 2μl (4μg /μl 6-OHDA in PBS) solution of 6-OHDA in experimental group. Saline containing 2% vitamin C with isometry injected to same location in control group. Examinating cortical latency (CL)、 central conduction (CCT )before operation, a week and three weeks later after operation. Statistical analysis was done using SPSS11.5 software.Results: A week after operation, CL、 CCT of left lower limb was significantly low in the experimental group (P<0.05) as compared with the control group, In the experimental group, CL、 CCT of left lower limb significantly lower than right (P<0.05), Three weeks after operation, CL、 CCTof left lower limb was significantly low in the experimental group (P<0.05) as compared with the control group, And CL、 CCT of left lower limb significantly lower than right (P<0.01).Conclusions: Our study revealed the cortex excitability was increased. PD model Following state of the illness got worse and the course of disease got longer in PD model rats, the cortex excitability was more increased.

    【Key words】Parkinson's disease model; Rats; Transcranial magnetic stimulation; Motor evoked potentials; Cortical latency；Central conduction

    以往的观点认为PD的病变限于锥体外系统，随着神经电生理学的发展，发现PD除锥体外系病变外，其它神经通路也受累，对帕金森病TMS-MEP的研究，目前尚无一致结论，且均为对PD病人的TMS-MEP的研究，因临床病人的混杂因素多，很难达到一致性，为此，本实验拟采用6-OHDA右侧黑质致密部和中脑腹侧背盖两点注射法制备偏侧帕金森病大鼠模型，对模型大鼠于不同时间点行TMS-MEP检测，观察帕金森病是否存在运动传导通路的损害，以及TMS-MEP是否随着病情变化。

    1  材料与方法

    1.1  动物及分组  健康SD雄性大鼠40只，由河北医科大学实验动物中心提供，体重270~300 g，鼠龄3~4个月，经行为检测确认无旋转行为后将40只大鼠随机分为2组：①实验组（PD模型组），28只大鼠制备6-OHDA PD模型，随机选取模型成功的大鼠12只，观察制模型前后的Ct变化；②对照组（生理盐水组），12只大鼠，用于实验对照，观察手术前后的Ct变化。

    1.2  帕金森病大鼠模型的制备  制作PD大鼠模型: 10%水合氯醛 0.5 ml/100 g腹腔注射麻醉，头颅水平位固定在大鼠脑立体定位仪上，上切牙平面比耳间线平面低2.4 mm(即齿棒低于耳间线)，保证前、后囟处于同一水平面，剃除大鼠头顶部毛发，手术区消毒，于颅中部正中切开头皮和筋膜，切口长度1.5 cm，剥离骨膜，使前囟充分暴露，确定右侧SNc、VTA三维坐标位置。SNc区坐标:前囟后4.8 mm，中线右侧1.0 mm，硬膜下7.8 mm。VTA区坐标:前囟后4.4 mm，中线右侧1.2 mm，硬膜下7.8 mm，确定具体坐标并标记，用牙科钻，小心钻透颅骨，用5 μl微量注射器抽取4 μg/ul 的6-OHDA溶液（含0.2%VitC的生理盐水）4 ul，按坐标每个点注射2 μl，注射时缓慢进针，注射速度1 μl/min，注射完毕停针10分钟，按1.0 mm/min速度缓慢拔针，明胶海绵填塞颅骨孔，缝合皮肤、筋膜。术后青霉素（5万单位/天）腹腔注射1周，预防感染。

    1.3  假手术组大鼠的制备  用上述同样方法向两坐标点每点注射2 μl生理盐水(含0.2%VitC)。

    1.4  行为检测  术后1周开始行为检测，应用阿朴吗啡(Apomorphine,APO)腹腔注射(0.5 mg/kg体重)，观察大鼠旋转行为变化，每周1次，连续6周，观测时间为30分钟/次，规定大鼠恒定转向左侧、身体环曲、首尾相接、360度为一转(r)、且旋转圈数>210 r/30 min，为成功PD大鼠模型, 否则予以淘汰。若大鼠不出现旋转、旋转方向不恒定、恒定转向右侧或恒定转向左侧但速度较慢(<210 r/30 min)，则视为失败PD模型。

    1.5  经颅磁刺激运动诱发电位的检查  所有大鼠于术前、术后1周、3周均行双下肢TMS-MEP检查。大鼠TMS-MEP在安静的电屏蔽室(室温20~24 ℃)内记录。10％水合氯醛 0.4 ml/100 g腹腔注射麻醉大鼠，使用Magstim 220型磁刺激仪和S90型圆形线圈，外径9.0 cm，最大输出磁场强度1.9 Tesla，磁线圈的放置方式为刺激左侧大脑半球时线圈A面向上，刺激右侧大脑半球时B面向上。每两次磁刺激间隔至少5秒，以防止上一个刺激对下一个刺激的易化。将线圈的中心放置在国际脑电图10~20系统Cz部位，适当移动线圈的位置，用刺激器最大输出量60%的刺激强度在大脑半球对侧下肢记录到最短潜伏期、最大波幅的部位为最佳刺激部位，将该部位标记。将线圈的中心置于标记处并与头皮相切，线圈柄朝后，每次测试至少重复刺激2次以获得稳定的波形，电容放电最大输出1 000 A。以TMS诱发MEP (最少3次)的最短起始潜伏期作为皮层潜伏期（cortical latency,CL），由皮层MEP潜伏期减去腰部(L4)刺激MEP潜伏期计算得到头～L4段中枢传导时间(Central Conduction Time,CCT)。

    1.6  记录  同心圆针电极置于双下肢腓肠肌肌腹作为记录电极，记录头皮刺激的对侧下肢腓肠肌的诱发肌电位，单极针电极置于鼠尾作为接地电极，各电极阻抗均小于5 kΩ。磁刺激信号经Counterpoint型肌电图仪放大，滤波带通20～2000 Hz，分析时程50 ms。

    1.7  统计方法  将实验组第1周时APO诱导符合PD成模标准的大鼠随机抽取12只，将其TMS-MEP数据与对照组比较。本实验全部采用SPSS 11.5版本进行统计分析。主要采用2种统计方法:①对同一时间点不同处理组间实验数据的比较采用两样本均数比较的t检验，各组内同一时间点左右侧运动诱发电位的比较采用配对t检验。②3组以上成组资料均值比较采用完全随机的单因素方差分析（采用该方法分析的数据全部经过方差齐性检验及正态性检验），在有意义的情况下行两两比较的q检验。所有数据均以均数±标准差表示，P<0.05为差异有显著性。

    2  结果

    2.1  一般观察  生理盐水组所有大鼠术后均正常生存。实验组有3只大鼠于术后死亡，其余大鼠经APO诱导有18只符合PD成模标准。

    2.2  术后大鼠神经症状和体征  术后1周开始给予腹腔注射APO，观察其诱导旋转行为变化，模标准，3周后20只出现恒定向左侧旋转行为，其中18只达到PD模型标准，模型成功率为62.28%，术后4、5、6周恒定向左侧旋转大鼠数量未见增加，术后3周与术后1周行为检测，大鼠旋转圈数有所差异，术后3周的旋转圈数较术后1周增加，具统计学意义（P<0.05）。旋转行为一般于腹腔注射APO后15 min内开始出现， 5只大鼠始终无旋转，生理盐水对照组大鼠APO诱导无旋转行为及其它异常行为。

    2.3  大鼠经颅磁刺激运动诱发电位的观察  ①制模前实验组大鼠左下肢及右下肢CL、 CCT与对照组比较，无统计学意义(P>0.05)。实验组及对照组大鼠自身左右下肢CL、 CCT比较均无统计学意义(P>0.05)。②制模后1周，实验组大鼠左下肢CL、 CCT较对照组大鼠缩短，具统计学意义(P<0.05)，实验组大鼠右下肢CL、 CCT与对照组比较无统计学意义(P>0.05)。实验组大鼠自身左右侧下肢CL、 CCT比较，左下肢CL、 CCT较右下肢缩短(P<0.01)。对照组大鼠自身左右侧比较无统计学意义(P>0.05)。③制模后3周，实验组大鼠左下肢CL、 CCT较对照组缩短(P<0.01)。实验组大鼠右下肢CL、 CCT与对照组大鼠右下肢比较无统计学意义(P>0.05)。实验组大鼠自身左右侧下肢TMS-MEP比较，左下肢CL、 CCT较右下肢缩短(P<0.01)。对照组大鼠自身左右侧CL、 CCT比较无统计学意义(P>0.05)。④制模前、制模后1周、制模后3周实验组大鼠左下肢Ct三个时间点两两比较均具统计学意义：CL、 CCT逐渐缩短(P<0.01)。右下肢CL、 CCT比较无统计学意义(P>0.05)。⑤制模前、制模后1周、制模后3周对照组大鼠左下肢、右下肢CL、 CCT比较无统计学意义(P>0.05)。表1  制模前、制模后1周、制模后3周实验组与对照组及实验组自身双下肢运动诱发电位潜伏期的比较表2  制模前、制模后1周、制模后3周实验组与对照组及实验组自身双下肢运动诱发电位中枢传导时间的比较*:P<0.05，**:P<0.01。

    3  讨论

    对PD是否存在运动传导通路的损害及其损害的具体表现，国内外学者对PD病人的运动诱发电位做了大量的研究，但目前为止尚无一致结论。因临床PD病人混杂因素多，运动诱发电位又与年龄、身长、臂长有关，且受药物的影响［1］，故很难达到病人条件一致性，而本研究采用的6-OHDA偏侧帕金森病大鼠模型行TMS-MEP检查，排除了以上不足，能够为临床PD病人是否存在运动诱发电位的改变及其具体表现提供有力的佐证。 6-OHDA帕金森病动物模型是国际公认的PD动物模型，利用此法建立的大鼠PD模型行为检测明显，神经化学改变更接近人类PD，这种模型可以建立稳定的类似于人类PD病理改变［2］。Bhatia M等［3］研究了19例PD患者的TMS-MEP，结果发现CL、 CCT和正常对照组相比无统计学意义。但Kandler［4］报道以强直为主及以运动迟缓为主的PD患者CL、 CCT均缩短［5］。本研究显示PD模型大鼠损毁侧的对侧下肢TMS-MEP皮层CL、 CCT均缩短，表明PD模型大鼠损毁侧对侧下肢运动通路的完整性受到破坏。潜伏期在MEP中是最容易测定和最可靠的，MEP反应的CL与快传播性的皮质脊髓束的激活一致，CL的缩短提示中枢神经运动传导通路受损。CCT表示皮质脊髓通路的神经冲动快速到达α-运动神经元的时间，是反映皮质脊髓神经元轴突最大传导速度的直接指标，用来评价上运动神经元是否存在传导障碍，本研究显示PD模型大鼠损毁侧的对侧下肢CCT缩短，表明支配损毁侧对侧下肢(即左下肢)肌肉的运动神经传导通路受损，MEP的传导途径，各作者尚有不同看法，多数学者认为MEP是沿皮质脊髓束、红核脊髓束等位于脊髓前索和前外侧索的运动束传导［6］。TMS是通过突触输入间接激活锥体神经元，运动束的受损表现为CCT的延长，CCT缩短表明突触间传导时间缩短，提示PD运动传导通路的损害部位很可能局限于运动皮层。已有研究［7］发现帕金森病模型大鼠损毁侧额叶皮质的突触数量较对侧减少，突触前、后膜和突触小泡结构异常，本项研究中实验组大鼠损毁侧对侧下肢的TMS-MEP的CL、CCT与对照组及对侧比较均显著缩短,其机制可能为损毁侧额叶突触数量减少、结构异常导致运动皮层兴奋性传导时间缩短，固有潜伏期和中枢传导时间的缩短。

【参考文献】
  ［1］ Bagnato S,Agostino R,Modugno,et al.Plasticity of the motor cortex in Parkinson's disease patients on and off therapy.Mov Disord. 2005, Dec, 13, Epub ahead of print.

［2］ 周厚广，陆建明，鲍远程，等.6-羟基多巴胺帕机森病大鼠模型的建立与评价［J］.中国行为医学科学,2002,11(1)：4-7.

［3］ Bhatia M, Johri S, Behari M.Increased cortical excitability with longer duration of Parkinson's disease as evaluated by transcranial magnetic stimulation［J］.Neurology India，2003, 51(1):13-15.

［4］ Kandler RH, Jarret JA, Sagar HJ, et al. Abnormalities of Central Motor Conduction in Parkinson's Disease［J］.Neurol Sci，1990,100(1-2):94-97.

［5］ Dioszeghy P, Hidasi E, Mechler F. Study of central motor functions using magnetic stimulation in Parkinson's disease［J］.Electromyogr Clin Neurophysiol，1999,39(2):101-105.

［6］ 沈 彬，宋跃明，运动诱发电位研究现状［J］.中国脊柱脊髓杂志,1999,9(3)：170-172.

［7］ 高 波，刘树伟，雷 皓.帕金森病大鼠模型额叶皮质的代谢及形态改变［J］.解剖学杂志,2004,27(3): 219-223.

作者单位：内蒙古医学院附属医院神经内科，内蒙古 呼和浩特 010050