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【摘要】 目的：建立大鼠外伤后癫痫模型并观察脑铁离子的代谢变化。方法：将铁离子注射到SD大鼠大脑感觉运动皮层，对照组给予相同操作但不注射铁离子。用火焰原子吸收光谱法测定脑组织中铁含量。结果：模型大鼠的脑铁含量在观察时间段呈逐渐降低的趋势。结论：铁可能是是外伤后癫痫形成机制的始动因素。
【关键词】 外伤后癫痫；氯化铁；脑电图
Intracortical injection of Ferric Chloride induced Posttraumatic Epilepsy Model
YAN Guan - Ru, LIU Shao -Ming, SI Jun - Qiang，et al
(Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Disease, Shihezi University, Xinjiang 832000, China; Department Neurosurgery, The Urumqi General Hospital of Lanzhou Military District, Urumqi)
【Abstract】 Objective：To get the rat model of posttraumatic epilepsy and observe the change of iron metabolism in the brain of the posttraumatic epilepsy (PTE) animal model. Methods:FeCl3 was injected over a period of 5 minute into the sensorimotor cortex by a microinjection syringe . The control group was treated by same operation , but no iron introduction . Detected the content of the iron in the brain tissue by Flame Atomic Absorption Spectrometry.Results: The content of the iron was decreased in the brain tissue of the posttraumatic epilepsy animal model , and had a tendency of decrease with the development of time.Conclusions: Iron may be an onset factor of the mechanism of PTE.
【Key words】Posttraumatic Epilepsy ; Ferric Chloride ; Electroencephalograms
脑外伤是最重要的癫痫易感因素之一，在青少年中表现尤为突出［1］。理解癫痫的分子、细胞级联反应是阻止疾病形成或减轻疾病的关键。外伤后癫痫(post traumatic epilepsy, PTE)模型可促进对致痫机制的理解，并有助于新的抗癫痫治疗方法的形成和检验。在众多PTE的动物模型中，以铁离子致痫动物模型较接近临床过程［2］。但目前为止，铁在模型动物脑中的代谢变化研究较为少见。为此我们观察铁离子的代谢变化以探讨铁离子诱导PTE实验动物模型的稳定性和可靠性。
1 材料与方法
1.1 材料 大鼠立体定位仪(美国ASI 公司) 。六水合氯化铁（FeCl3·6H2O，购自美国Sigma 公司）。无线蓝牙脑电监测系统(上海诺成电气有限公司) 。外科显微手术钻1 套。牙托粉。50 μl 微量注射器1 个。针灸针若干。
1.2 动物及分组 健康成年雄性Sprague Dawley (SD)大鼠40只(由新疆医科大学动物中心提供)，体重200～250 g，随机分为5组：正常对照组(A组)8只、手术对照组 (B组)8只、FeCl3注射组（C组），其中C组又按时间分为注射后24 h组（C1组）、5 d组（C2组）、15 d组（C3组）各8只。
1.3 癫痫模型制作 大鼠称重后以2 %异戊巴比妥钠溶液(50 mg/ kg 体重) 腹腔注射麻醉,立体定位仪上固定。剪去头顶的毛,常规消毒头顶皮肤后沿头顶正中线切开头皮,切口长约3 cm。剥离头顶筋膜,暴露颅骨。在左侧颅骨冠状缝后3 mm、矢状缝旁2 mm 处用外科显微手术钻钻一直径为2 mm 的孔。另外再钻5 个直径2 mm 安放电极的孔,孔的位置按D'Ambrosio 所采用的方法［3］ ,即以前囟点为原心,矢状缝为y 轴,过原点垂直于y 轴的直线为x 轴,坐标轴单位为mm。孔的坐标分别为(4,0),(4,-6),(-4,0),(-4,-6),最后在额骨正中钻一直径为2 mm 的孔。用微量注射器将5 μl 浓度为100 mmol/L 、pH 值为1.5的FeCl3溶液在5 min 内匀速注射到大鼠的感觉运动皮质区内,进针深度3 mm。溶液注射完以后,留滞针头5 min。脑电记录:将前端钝圆的纯银丝置于上述钻好的安放电极的孔的硬脑膜外,用牙托粉将银丝与颅骨牢固地固定起来,银丝的另一端连接无线篮牙脑电监测系统来监测大鼠的脑电图。手术对照组在同一部位注入等量的生理盐水。
1.4 标本采集与检测 大鼠麻醉后放血处死，迅速取出脑组织，实验组取大鼠左侧大脑半球冠状缝与人字缝之间的脑组织作为实验样品，正常对照组及手术对照组取样方式同实验组。脑组织取出后用0.1 mol/L PBS 缓冲液 (pH 7.2) 冲洗3 次，吸水纸吸去表面残留液体，称重后立即放入-20 ℃冰箱内保存。待所有标本收集完后，将脑组织放在冰水混合物中解冻，解冻后按1∶10（重量/ 容积）的比例加入预冷过的0.1 mol/L PBS 缓冲液（pH 7.2）制成组织匀浆，HNO3－HClO4湿法消化后，采用脉冲微量进样火焰原子吸收光谱法测定脑组织中铁含量。
1.5 统计学方法 用SPSS 13.0软件进行方差分析，P<0.05表示有统计学意义。
2 结果
2.1 行为学观察 自注入FeCl3溶液至大鼠清醒约2 h 期间,大鼠基本处于麻醉状态,偶有身体的轻微颤抖,基本没有自主活动。模型建立后2～3 h 期间,大鼠开始出现癫痫发作。发作形式表现为头向右偏, 身体顺时针旋转, 持续时间约0.5～1.0 min ,约每30 min 发作1 次，或表现为湿狗样运动，呈阵发性。模型建立后3 h左右大鼠开始出现典型的癫痫大发作。发作形式表现为身体向右后扭转,上半身抬起,整个身体背曲强直,翻转跳起,跳起时离地高度约20～30 cm , 随后顺时针急速奔跑，而后四肢剧烈抽搐，尾巴翘起，同时可见大鼠双眼眼裂变大,眼球向外凸出,并伴随出现尿失禁现象。模型建立后3～5 h 期间,约每10～20 min 发作1 次,每次持续时间约1 min。模型建立后5～8 h 期间,大鼠癫痫发作频率逐渐下降,每0.5～1.0 h发作1 次。大鼠在癫痫大发作的间期,交叉出现咀嚼自动症。表现为下颌快速咬动与面肌抽搐交替出现,在面肌抽搐的同时伴随出现与面肌抽搐节律一致的双眼睑裂变大,眼球向外凸出,持续时间1～2 min。模型建立后24 h～1 周内,大鼠癫痫发作比较频繁,约每天发作1 次,主要表现为咀嚼自动症,身体不自主的抽动。模型建立后第2 周内,大鼠癫痫发作频率有所下降,每2～5 d 发作1 次。模型建立2 周以后,未再观察。
2.2 脑电图记录 记录PTE大鼠模型术后24 h的脑电变化。每组大鼠在接受处理前各描记脑电图（Electroencephalograms, EEG）1 h。
2.2.1 正常大鼠脑电(EEG)波形 正常大鼠的EEG频率以6～10 Hz为主，波幅小于200 mV。 (图1)。生理盐水注射后，脑电波形无明显变化。
图1 正常大鼠脑电图（略）
2.2.2 氯化亚铁注射后大鼠EEG 变化 模型建立后3 h 首次出现频率明显加快、波幅明显高出背景波的棘波放电,癫痫波起源于左侧注射部位的感觉运动皮质区,以注射侧及注射对侧的感觉运动皮质区显著(图2) ,癫痫波出现同时大鼠行为学上表现为身体背曲强直,四肢抽搐;术后5 d 和术后15 d 时脑电图上出现的癫痫波主要为棘慢波及尖慢波;发作间期可见散在出现的尖波及尖慢波活动。
图2 PTE大鼠发作期脑电图（略）
2.3 铁含量检测 从表1中可见，铁含量在注射FeCl3 溶液的PTE 大鼠模型脑组织内均逐渐降低, 且A 组和B 组之间Fe含量没有差别，这排除了手术损伤对实验结果的影响。
表1 PTE大鼠脑内铁含量（略）
FeCl3模型组在术后24小时、5天和15天时脑组织内的铁含量均高于正常对照组，且术后5天低于术后24小时，术后15天低于术后5天，在观察时间段呈逐渐降低的趋势。铁含量统计图见图3。
图3 PTE大鼠脑内铁含量统计图（略）
3 讨论
目前PTE动物模型研究较多的有脑外伤（Traumatic brain injury，TBI）模型和铁离子注射模型。近年来人们开始采用临床相关性更强的TBI动物模型触发PTE。这些TBI动物模型能更好地模拟人TBI的病理特点如皮层挫伤、血脑屏障破坏、皮层下损害及轴突损伤等［4］。在有关创伤的文献中，TBI动物模型主要有6类：局灶性、弥漫性、局灶与弥漫混合性、TBI联合性损伤、昏迷模型和重复性震荡模型 。但在TBI动物模型研究中，只在侧方液震脑损伤模型(1ateral fluid-percussion model of brain injury，FPI)中进行有关迟发性反复性自发癫痫发作的系统性研究［3,5］。而且液压损伤模型死亡率较高，成功率较低［5］，只有40%～50%。而铁离子注射模型和临床过程比较相似，且死亡率低，成功率高。在铁离子注射模型中，又有注射不同部位和不同浓度的探讨。可是对于铁在模型动物脑中的代谢变化研究较为少见，本实验将100 mmol/L FeCl3注射到大鼠的皮质感觉运动区后，3 h出现频率明显加快、波幅明显高出背景波的棘波放电,癫痫波起源于左侧注射部位的感觉运动皮质区,以注射侧及注射对侧的感觉运动皮质区显著。术后5 d 和术后15 d 时脑电图上出现的癫痫波主要为棘慢波及尖慢波;发作间期可见散在出现的尖波及尖慢波活动。Fe含量在注射FeCl3 溶液的PTE大鼠模型脑组织内均逐渐降低,且术后5天低于术后24小时，术后15天低于术后5天，在观察时间段呈逐渐降低的趋势。这种现象说明铁可能是癫痫形成机制的始动因素。可能是铁的氧化导致了氧、羟自由基及过氧化氢的生成，这些物质作用于多不饱和脂肪酸及细胞膜，造成脱氢及过氧化反应的随后传递。这种非酶促的脂质过氧化反应的启动、传递引起细胞膜破裂及微环境的改变，导致了癫痫发作。铁离子注射模型的成功率高，稳定可靠，可尝试通过抑制铁的始动作用控制外伤后癫痫的发作，为进一步阐明PTE发病机制、防治PTE的研究，提供了理想的动物模型。
【参考文献】
［1］ Pitk nen A, McIntosh TK. Animal models of post-traumatic epilepsy［J］. Neurotrauma, 2006,23(2):241-261.
［2］ Mori A, Yokoi I，Noda Y, et a1．Natural antioxidants may prevent posttraumatic epilepsy： a proposal based on experimental animal studies［J］. Acta Med Okayama，2004，58(3)：111-118.
［3］ D'Ambrosio R, Fairbanks J P, Fender J S, et al. Post-traumatic epilepsy following fluid percussion injury in the rat［J］. Brain ,2004 ,127(2) :304-314.
［4］ Morales DM, Marklund N, Lebold D, et al. Experimental models of traumatic brain injury：do we really need to build a better mousetrap?［J］. Neuroscience,2005,136(4):971-989.
［5］ Kharatishvili I, Nissinen JP，McIntosh TK，et a1．A model of posttraumatic epilepsy induced by lateral fluid-percussion brain injury in rats［J］. Neuroscience, 2006, 140(2):685-697.
作者单位：石河子大学新疆地方与民族高发病实验室-生理，新疆 石河子 832000； 兰州军区乌鲁木齐总医院神经外科