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【关键词】 基质金属蛋白酶组织抑制剂；结肠癌；侵袭转移
结肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，按照Dukes分期，结肠癌的5年生存率与肿瘤的侵袭和转移能力密切相关。因此，寻找能反映结肠癌细胞侵袭和转移潜能的标记物己成为研究的热点，明确这些标记物有利于肿瘤的早期诊断、预测病情发展、指导临床治疗及改善患者预后。基质金属蛋白酶组织抑制剂TIMP-2是细胞外基质降解过程中的重要酶类，与肿瘤的侵袭和转移有着密切的关系。
1 材料与方法
1.1 临床资料 收集吉林市第二中心医院病理科2006年1月至2009年1月期间普通外科手术切除经病理诊断的结肠癌标本的存档蜡块，共35例。男性25例，女性10例;年龄35～85岁，平均55岁。根据病例临床及病理学资料分组:大体类型:肿块型14例，浸润型10例，溃疡型11例;组织学类型:按照2000年WHO新的结肠肿瘤组织学分类标准及我国的分类特点分类：①管状腺癌12例，黏液腺癌18例，印戒细胞癌5例；②分化程度:高分化腺癌18例，中低分化腺癌17例；③Dukes分期:A+B期15例，C+D期20例；④淋巴结转移:无淋巴结转移者18例，有淋巴结转移者17例；另收集正常结肠黏膜标本20例作为对照。
1.2 实验方法 采用SP免疫组织化学方法:(l)切片常规脱蜡和水化后，PBS漂洗3次，每次3 min；(2)于湿盒内用3%过氧化氢溶液(A液)室温孵育10 min；(3)滴加5%～10%封闭用正常动物非免疫血清工作液(B液)；(4)滴加一抗工作液，TIMP-2于37摄氏度孵育箱内孵育5个小时，PB漂洗3次，每次3 min；(5)滴加生物素标记二抗工作液(C液)；(6)滴加辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素工作液；(7)配制新鲜的DAB显色剂；(8)苏木素复染细胞核，染色时间约为HE染色的半量 (2 min)。
1.3 结果判定 (1)阳性对照:用随试剂提供的己知阳性片作为阳性对照。(2)阴性对照:实验中用PBS缓冲液代替一抗做为阴性对照。TIMP-2为细胞质内表达，镜下观察肿瘤细胞胞质出现黄色、棕黄色、棕褐色细小颗粒状，染色明显高于背景为阳性。高倍镜下随机取5个视野,每个视野计数100个细胞,阳性细胞数＞10%定为阳性,阴性细胞数＜10%定为阴性。①阳性细胞百分率:未见阳性细胞者为0分，＜25%为l分，25%～75%为2分，＞75%为3分，②显色深浅:不显色或显色不清为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。以上两项相加最终评定结果：0～1分为阴性(-)，2～5分为阳性(+)，＞5分为强阳性(++)。用SPSS 12.0 for windows软件进行统计学处理。以P＜0.05确定差异有统计学意义。
2 结果
TIMP-2的表达在结肠癌不同性别、年龄 、肿瘤部位、大体类型、组织学类型、分化程度中差异均无统计学意义(P＞0.05);TIMP-2的表达在不同浸润深度、Dukes分期及是否淋巴结转移中差异明显 (P＜0.05)，且浸润深度越深、Dukes分期越晚、发生淋巴结转移者表达降低（见表1）。表1 TIMP-2在结肠癌中的表达与临床病理特征检验水准α=0.05。
3 讨论
结肠癌的生长、侵袭和转移是一个多阶段、多水平、多因素的过程，其中的关键步骤是降解肿瘤周围的基质。大量的实验证明，瘤细胞侵袭转移能力与其诱导产生蛋白酶、降解细胞外基质、基底膜的能力密切相关。基质金属蛋白酶抑制剂是基质金属蛋白酶主要的自然抑制物，确定的有TIMP-1至TIMP-4［1］。正常情况下基质金属蛋白酶与基质金属蛋白酶抑制剂在体内保持着相对的平衡状态，它们的平衡和相互影响决定着细胞基质的降解，从而在组织的修复、重塑、肿瘤细胞的浸润与转移中具有重要的意义。基质金属蛋白酶抑制剂通过抑制基质金属蛋白酶的活性，维持细胞外基质及基膜的完整性，阻止内皮细胞的迁移，抑制新生血管的形成，并阻止肿瘤细胞进入血液循环形成转移灶［2，3］。
基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP-2）是相对分子量为20 kDa的非糖基化蛋白,有194个氨基酸残基, 最先是从黑色素瘤细胞中分离出来，主要表达于软骨、胎盘滋养层、各种上皮及妊娠后期的肌肉中。基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP-2）在人类结肠癌中的表达尚存在争议，有些报道其表达升高，有些则认为其在肿瘤转移时表达下降，Kikuchi等［4］认为TIMP-2在结肠癌组织中的表达与瘤细胞的侵袭行为有关，而与肿瘤的转移无关。还有文献报导，TIMP-2能抑制肿瘤的入侵［5］。但Joo等［6］发现TIMP-2的高表达与结直肠癌的临床病理参数无关。本组研究发现TIMP-2 蛋白主要表达于肿瘤细胞的胞浆中，在癌组织中阳性表达率明显高于正常结直肠黏膜组织，强阳性表达率也明显高于正常结肠黏膜组织 (P＜0.05)，TIMP-2的表达在结肠癌不同年龄、性别、肿瘤部位、大体类型、组织学类型、分化程度中差异均无统计学意义(P＞0.05);在不同浸润深度,Dukes分期及淋巴结转移中差异明显(P＜0.05)，但浸润深度增加,分期晚者、发生淋巴结转移者表达减弱。提示在肿瘤晚期，机体产生的TIMP-2蛋白有降低趋势 ，导致肿瘤发生浸润和转移。
综上所述, 基质金属蛋白酶组织抑制剂与肿瘤的侵袭转移的关系,已为我们认识肿瘤进程的机理提供了有力的依据,随着这一领域研究的深入,将为临床肿瘤的诊断预防提供可信的指标,也为临床治疗肿瘤提供新的策略与方向，为结肠癌早期诊断、治疗及预后的评价提供重要的帮助。
【参考文献】
［1］ Groft LL,Muzik H,Rewcastle NB,et al.Differential expression and localization of TIMP-1 and TIMP-4 in human gliomas［J］.Br J Cancer,2001,85(1):55-63.
［2］ 路喜安，齐广强，梁建芳，等.基质金属蛋白酶及金属蛋白酶组织抑制因子与大肠癌转移的相关性研究［J］.中国药物与临床,2003,4(8)：337－338.
［3］ 张海伶， 郭文有， 路荣海，等.大肠癌中MMP-2、TIMP-2基因的表达及其对预后的影响［J］.中国现代医药杂志， 2007,19（3）：32-34.
［4］ Kikuchi R, Noghchi T,Takeno S, et al.Immunohistochemical detection of membrane-type-1-matrix metalloproteinase in color-ectal carcinoma［J］.Br J Cancer, 2000, 83(2):215-218.
［5］ 徐向明.MMP-2及TIMP-2在结直肠癌组织中的表达及意义［C］.山东大学硕士学位论文， 2007,5（10）:21-22.
［6］ Joo YE,Seo YH,Lee WS,et al. ExPression of tissue inhibitors of metalloProteinases(TIMPs)in hepatocellular carcinoma［J］.Korean J Intern Med，2000，15(3):171-178.
作者单位：吉林市第二中心医院，吉林 吉林 132011