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关键词 多药耐药 乳腺癌耐药蛋白 白血病 聚合酶链反应
The clinical and biological significance of breast cancer
resistance protein expression in acute leukemia
Wu Shuqing，Zhou Zhenghui，Li Jianyong，et al.
The People’s Hospital of Danyang，Jiangsu212300.
【Abstract】 Objective To evaluate the clinical and biological significance of breast cancer resistance protein（BCRP）expression in acute l;eukemia.MethodsThe expression of breast cancer resistance protein（BCRP）mRNA was measured in62patients with acute leukemia and in20normal control by using reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR），and the expression of P-gl;ycoprotein（P-gp）was investigated in25patients by using indirect immunnolfluorescence method.In this paper，β 2 -MG（a330bp of PCR product）was selected as an internal control for semi-quanitative analysis of BCRP（a446bp of PCR product）.Results The BCRP positive rate in nuˉtreated group was58.1%，significantly higher than that in control group.The CR rate in AML differed significantly beˉtween BCRP + （32%）and BCRP - （74%）（P<0.01），whereas there was no appreciable correlation between the CR rate and the level of BCRP expression in ALL.The BCRP positive rate of clinical resistant group was higher than that in CR group.The BCRP positive rate in normal control and CR group was very low.The BCRP expression was not corˉrelated with French-American-British Cooperative group（FAB）classificantion，immunophenotype and P-gp exˉpression.Conclusion The BCRP expression corrleated with chemotherapeuatic effect and prognosis.It is an unfavorˉable prognosistic factor for patients with untreated acute leukemia.
Key words leukemia multidrug resistance breast cancer resistant protein reverse transcription polymerase chain reaction
经典的多药耐药（MDR）是成人初治或难治急性白血病治疗失败的重要原因 ［1］ 。P-170糖蛋白（P-gp），多药耐药相关蛋白（MRP）和肺耐药蛋白（LRP）已被证明能够在肿瘤细胞系中对多种抗肿瘤药物产生耐药 ［2，3］ 。最近发现一种新的肿瘤耐药相关蛋白—乳腺癌耐药蛋白（breast cancer reˉsistance protein，BCRP），通过药物溢出泵机制导致耐药，我们采用RT-PCR方法，检测各种类型的白血病患者骨髓标本BCRP表达水平的高低，旨在研究BCRP基因表达水平对化疗及预后的影响，探讨其临床检测的实用价值。
1 资料和方法
1.1 一般资料 自2000年10月～2001年6月我院（少数为收治的62例初治成人急性白血病（AL）。按FAB标准诊断分型，且大多数经免疫分型及细胞遗传学证实，其中ALL14例，ANLL48例;男40例，女22例;年龄16～76岁，中位年龄35.2岁。20例正常对照组标本来自健康成人志愿者。
1.2 细胞分离及RNA提取 采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法 ［11］ 提取细胞总RNA，紫外光分光光度计准确定量，沉淀于无RNA ase水中，-80℃保存备用。
1.3 逆转录RNA合成互补DNA（cDNA） 取2μgRNA加入1μl六随机引物（Promega），加双蒸水至20μl，70℃预热5min，随之加入20μl逆转录反应体系中，其中含8μl5×buffer，0.1M DTT4μl，0.25mM dNTP（Pharmacia）2μl、1μlRNAsin（Pharmaˉcia）和200μlMMLV（Gibco BRL），37℃水浴中反应1h。
1.4 PCR反应 BCRP引物的设计及合成参考文献 ［8］ ，并经Gene Bank检索更正，由上海生工生物公司合成;内参照引物β 2 -MG参见文献 ［9，10］ 。两对引物序列BCRP正义链5-TTAGGATTGAAGCCAAAGG-3，反义链5-TAGˉGCAATTGTGAGGAAAATA-3，扩增产物446bp。β 2 -MG正义链5-CTCGCGCTACTCTCTCTTTC-3，反义链5-CATˉGTCTCG ATCCCACTTAAC-3，扩增产物330bp。PCR反应总体系为50μl，其中含5μl10×buffer，1μl0.25mM dNTP，BCRPβ 2 -MG引物各1μl，cDNA5μl和TaqDNA多聚酶0.3μl，BCRP、β 2 -MG扩增条件参照文献 ［8］ ，以变性94℃45s;退火55℃45s;延长72℃1min为循环，分别进行30、28个周期，最后在70℃再延长10min，终止PCR反应。
1.5 DNA电泳、照像、定量 取15μl PCR产物，在1.5%脂糖凝胶上进行电泳（80V、45min），EB染色，置紫外光检测仪上观察照像。底片置Appraise Dennetaeaster System电泳扫描仪（BECKMAN）上进行BCRP PCR扩增带的扫描，以计算其BCRP/β 2 -MG比值，判断标准为≥0.5为阳性，≥1.0为高表达。
1.6 P-gp表达的检测 取骨髓标本，肝素抗凝，常规分离单个核细胞，采用P-gp单克隆抗体UIC-2（法国Immˉmunotech公司）技术染色，流式细胞仪（FCM Epics XL型，Coulter，USA）检测。以UIC-2阳性细胞≥10%，定为阳性。
1.7 统计学处理 数据以均数±标准差（ˉx±s）表示，采用t检验及χ 2 检验。
2 结果
2.1 PCR阳性结果以肉眼能见其电泳扩增带为判断标准，当被检标本PCR后同时出现BCRP及β 2 -MG基因PCR电泳扩增带时，判定该标本BCRP PCR检出阳性，BCRP表达在正常人、MCF-7及AL患者的表达见图1。图1 PCR结果电泳图图M为PUC19/MSP MARKER;1为阴性对照2-7，9-15为部分病人标本，8为阳性对照
2.2 AL患者BCRP表达 共检测62例AL患者，与对照组相比，AL患者BCRP表达均明显增高，不同类型的白血病组间差异无显著性。20例正常人骨髓标本中，平均表达水平（BCRP/β 2 -MG比值）为0.30，分析BCRP基因表达的分布，将BCRP/β 2 -MG比值≥0.5定为BCRP表达增高，以BCRP + 表示。BCRP/β 2 -MG比值≥1.0定为高水平表达，按此标准，62例初诊病人BCRP+占58.06%，临床耐药组BCRP+