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【摘要】 目的 以米曲霉为菌种，优质大豆为培养基，研究生产纳豆的适宜条件。方法 以米曲霉为菌种，选择不同温度（34℃、37℃、40℃、46℃），不同pH（pH5.0、pH6.0、pH7.0、pH8.0、pH9.0），不同NaCl浓度（2%、5%、10%）及不同接种量（1%、2%、3%、4%），分别在恒温摇床上用液体培养基培养18h后，用比浊测其细胞量及用纤维平板法、体外溶栓法测其NK活性。比较测定最适宜条件后，在最适宜条件下测其生长曲线及NK活动。结果 在本实验生产条件下，米曲霉在37℃、pH7.0、NaCl浓度为2%、接种量为2%、种龄为18h的条件下生长最好，所得纳豆具良好活性。结论 用米曲霉生产纳豆，方法可行、实用，值得进一步研究和开发利用。
关键词 米曲霉 纳豆 菌量 NK活性
A study of the conditions of natto production with aspergillus oryzae Yuan Shuyun，Rao Yingzhu，Xia Jingmin，et al. Department of Laboratory Medicine，Zhanjiang Center People’s Hospital，Guangdong524037. 【Abstract】 Objective To find the optimum conditions by selecting Aspergillus oryzae as the bacillus source and excellent soja as medium.Methods Under the different conditions，such as different temperature（34℃、37℃、40℃、43℃、46℃），different pH（pH5.0、pH6.0、pH7.0、pH8.0、pH9.0），different consistence of NaCl（2%、5%、10%），different inoculums（1%、2%、3%、4%）for Nk production inliquid fermentation.In18hours，the cell quantity was determined by turbidmetricmethod，and the nattokinase activity was determined by fibrin plate method and isolaˉtion and thrombolyic method.Make the growing curve and the nattokinase activity under the optimum conditions.Reˉsults It showed that the optimum conditions for activity natto were:37℃，pH7.0，2%of NaCl，2%of inoculum of18h.Conclusion It is practical and useful to made Natto with Aspergillus oryzae，and it is worthy to carry out reˉsearching and developing work deeply. Key words aspergillus oryzae natto cell quantity NK activity 心脑血管病是目前危害人类健康的严重疾病，寻找并开发具有预防心脑血管疾病的保健食品，研制价廉、无副作用、高效的溶栓药物已成为当务之急。纳豆是日本的一种传统性食品，很早以前在民间就被作为治疗和预防心血管病的药物 ［1］ 。纳豆不仅营养丰富，它的功能还包括治疗感冒、防治酒醉、消除肩膀酸痛，提高肝功能，保持心脏、血管健康，医治口角炎、结核、腹泻及苦夏等症，另外还具有美容的功效 ［2］ 。 1987年，日本须见洋行从纳豆中提取出一种具有溶血栓功能的物质，定名为纳豆激酶（Nattokinase，NK） ［3］ ，10余年来，对纳豆激酶在药理、酶学特性等方面都进行了研究，NK具有安全性好，作用迅速，成本低等优点。该酶能显著溶解内外血栓，明显缩短优球蛋白的溶解时间，并能激活静脉内皮细胞产生纤维蛋白的溶酶原激活剂。可以认为，NK具有成为新型溶血栓药物的可能性 ［1，4～6］ 。 由于纳豆所具的独特风味和粘性，与我国的传统食品豆豉相似。本文初步探索用能制造豆豉的米曲霉来生产纳豆的方法，通过测定温渡、最初pH值、NaCl浓度、生长曲线、接种量等条件下的产酶量，以确定适宜的发酵条件。 1 材料与方法 1.1 仪器与设备 UV755B型紫外可见分光光度计（上海分析仪器总厂），电热恒温培养箱（南京实验仪器厂），电热手提压力蒸汽消毒锅（上海医用核子仪器厂），电热烘箱（南京实验仪器厂），SHA-C水浴恒温振荡器（江苏恒丰仪器厂）。 1.2 原料与试剂 原料:新鲜、颗粒饱满的大豆，米曲霉（用市售酱油曲精为菌源）。试剂:牛肉膏、蛋白胨、NaCl、自来水、纤维蛋白原 ［7］ 、凝血酶 ［7］ 、尿激酶。液体培养基 ［8］ :牛肉膏5g，蛋白胨10g、NaCl5g、自来水1000ml，加热溶解后用纱布过滤，调pH至7.2～7.4，121℃灭菌20min。固体培养基:采用市售大豆，经挑选后，浸泡24h，121℃蒸煮2h后备用。 1.3 研究方法 1.3.1 温度的选择 取5ml液体培养基于15ml的试管中，接种2%的菌液，分别在36℃、38℃、40℃、42℃、44℃，以120r/min的转速在恒温摇床上培养18h。以同条件下未接种培养液为空白对照，利用比浊法（OD 540 ）测其细胞量，用纤维平板法测其活力。 1.3.2 初始pH的选择 取5ml液体培养基于15ml的试管中，分别用HCl及NaOH调pH值为5、6、7、8、9五个梯度，接种2%菌液，其它培养条件及测定方法同1.3.1。 1.3.3 NaCl浓度的选择 取5ml液体培养基于15ml的试管中，分别在NaCl浓度为2.0%、5.0%、10.0%时，接种2%的菌液。其它培养条件及测定方法同1.3.1。 1.3.4 生长曲线的测定 取100ml液体培养基于250ml的三角烧瓶中，接种2%菌液在37℃、pH7.0下，以120r/min的转速，在恒温摇床上培养，从0h开始，每隔3h取出一组（2瓶），直到37h，以在同条件下未接种培养液为空白对照，测定方法同1.3.1。 1.3.5 接种量的选择 取几等份蒸煮好的大豆于相同的容器中，加入不同量（1%、2%、3%、4%四个梯度）的菌液，在相同条件下发酵。测定方法同1.3.1。 1.3.6 NK活性测定 1.3.6.1 纤维蛋白平板法测NK活性 参照文献方法 ［7，9］ ，制作纤维蛋白平板。按Astrup法 ［10］ 在同一纤维平板内，不同两点处分别加10μl的纳豆粗提液，标号Ⅰ，另一点滴加10μl100IU/ml的尿激酶，标号Ⅱ。置于37℃培养箱中保温18h后取出，用卡尺量取溶圈的直径，计算溶圈的面积，两点取平均值，按mm 2 /ml表示纤溶活力，从而计算出样品的活性相当于尿激酶单位数。 样品酶活（IU/ml）=（样品溶圈面积平均值/标准UK溶圈面积平均值）×100。 1.3.6.2 对鸡血凝块的溶解实验 取一定量刚凝固的鸡全血置于生理盐水中漂洗60min，以洗去凝块上的血细胞。漂洗后将鸡全血分成若干份1cm 2 面积大小的血块烘干并称其干重W n （n=1，2，……n），然后将各凝块分装于不同的试管中。分3组:1组加入2ml纳豆粗提液，1组以等体积的尿激酶为阳性对照，另1组以生理盐水为阴性对照。将各组于37℃水浴中保温1.5、3、4.5h，并于各时间段将凝块取出，在生理盐水中漂洗、烘干、称得干重G n （1，2，……n）按下式计算血块溶解率 ［11］ : 血块溶解率（%）=（W n -G n ）/W×100% 1.3.7 用米曲霉产生纳豆的实验流程 精选大豆———清洗———浸泡———蒸煮———接种———发酵———成熟———测定细胞量及NK活性。 2 结果 2.1 米曲霉生长特性 2.1.1 最适温度 不同温度下培养米曲霉的OD 540 、NK活性测定结果见图1，从图1可看出，经不同温度下培养后，米曲霉在37℃时的OD 540 最大，活性也最强，因此认为其最适生长温度为37℃。 图1 温度对米曲霉的影响 2.1.2 最适初始pH 不同初始pH培养后的OD 540 及NK活性测定结果见图2。由图2可看出:当初始pH小于7.0 时，其OD 540 随pH的升高而增大，酶活力也不断增大，当初始pH大于7.0，酶活力随pH的升高而减小，说明米曲霉生长的最适初始pH为7.0。 图2 不同pH对米曲霉的影响 2.1.3 最适NaCl浓度 不同NaCl浓度下培养后的OD 540 测定结果见图3，由图3可知随着NaCl浓度的增大，OD值减少，当NaCl浓度为2%时，米曲霉的菌量最多，同时，通过活性测定发现，当NaCl浓度为5%和10%时，不产生溶圈，即没有酶活力。可见其最适生长NaCl浓度为2%。图3 不同NaCl浓度对米曲霉的影响 2.1.4 生长曲线 以初始pH7.0、NaCl浓度2%及37℃下测得的OD 540 见图4，从图4可见，0～6h为米曲霉的延滞期，6～18h为对数生长期，18～21h为稳定期，21h后为衰亡期，所以其最适接种种龄是18h。同时测得各时间段内，纳豆的NK活性在18h时最强。无论是生长还是产酶都以种龄为18h为宜。图4 米曲霉的生长曲线及其活力 2.1.5 接种量 不同接种量培养后测得的OD 540 见图5。由图5可见，当接种量为3%的时候，细菌生长