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【摘要】 目的 肥大细胞及其分泌的组胺具有促进组织修复的作用，为探讨电针对创伤修复的影响，本文动态观察了电针对肉芽组织局部肥大细胞数量及组胺含量的影响。方法采用甲苯胺蓝方法显示肥大细胞，荧光方法测定组胺含量。结果 电针使肉芽组织及其边缘肥大细胞数量增加（P<0.01），组胺含量上升（P<0.01），创伤初期肥大细胞以释放组胺为主。结论 电针可通过刺激肥大细胞数量增加及其释放介质促进创伤修复。
关键词 电针 肉芽组织 肥大细胞 组胺
Effect of electro-acupuncture on amount of mast cell
and content of histamine in local wound
Zhou Yanjie
Department of Basic Medical，Zhejiang University of TCM，Hangzhou310053.
【Abstract】 Objective Mast cell（MC）and histamine can be helpful to wound repair.To explore the role of electro-acupuncture in wound repair，we studied amount of mast cell and content of histamine which secreted by MC in the local ofgranulation tissue.Methods Toluidine blue was used to stainingMC and fluorescence method to deterˉmin content of histamine.Results Electro-acupuncture can increase amount of mast cell（P<0.01）and content of histamine（P<0.01）which secreted byMC in the local of granulation tissue.Conclusion Electro-acupuncture can be helpful to wound repair by stimulating MC hyperplasia and histamine secret.
Key words electro-acupuncture granulation tissue mast cell histamine
肥大细胞（mast cell，MC）广泛分布于全身结缔组织中，尤以接受外界刺激较多的部位（如粘膜下、皮下）居多。肥大细胞除参与变态反应性疾病、免疫调节之外，在创伤修复的各个阶段，通过分泌不同的生物活性物质（如组胺、肝素等）而参与不同的生理病理过程。以往有关针刺对肥大细胞及其介质的影响多从变态反应性疾病角度探讨，本文以皮肤切割伤大鼠为模型，动态观察了针刺对创伤组织局部肥大细胞数量及组胺含量的影响，并借以探讨肥大细胞及其介质在创伤修复中的作用及针刺的干预作用。
1 材料和方法
1.1 实验动物及分组 SD大白鼠120只，体重180～220g，雌雄各半，随机分为对照组、模型组、治疗组三个大组，每大组40只，再按治疗时间（依次为1、3、7、10、15天）将每大组分为5个小组。
1.2 造模 参照文献 ［1］ 方法并做适当改进:术前用硫化钠脱毛，乙醚吸入麻醉，于背部正中约T 10 ～L 1 处消毒后做1cm×1.5cm的长方形切口，切除全层皮肤，消毒纱布压迫止血，术后动物自然清醒，单笼喂养，充足给水。
1.3 治疗 参照《中国兽医针灸学》及人体取穴方法定位，针刺双侧“足三里”，提插捻转后连接WQ-10A型多用电子穴位测定治疗仪，波形为连续波，频率2Hz，电压2～4V，此时可见足趾轻微抖动。每日1次，每次15min。
1.4 标本采集 大鼠脱臼处死后，于创面取二块组织，其中一块为条形，带少许正常皮肤组织，约5mm×5mm× 3mm，投入10%中性缓冲甲醛溶液中固定后做组织切片;另外一块称重后进行组胺含量测定。
1.5 检测方法 （1）肥大细胞计数:组织几经常规脱水，石蜡包埋，切片后行甲苯胺蓝染色 ［2］ ，显示创面肉芽组织及创缘皮下组织的肥大细胞，于光学显微镜下连续计数四个方框（×400倍，每个方框面积为125μm 2 ）的肥大细胞数量，取其平均值。（2）组胺含量测定:参照向氏 ［3］ 等方法进行，取创面肉芽组织称重后加25%三氯乙酸匀浆，4000r/min离心10min，取上清液1.6ml置于已加1.5g NaCl具塞试管中，再加4.0ml正丁醇和0.2ml2.5NNaOH，立即混匀，置康氏震荡器上震荡5min，静置后取3.6ml正丁醇相加到已加1.2ml0.1N HCl和2.0ml正庚烷的10ml具塞试管内，震荡5min，弃有机相，取1.0ml HCl相置于10ml反应管中，用三蒸水稀释一倍后加0.5ml0.4N NaOH碱化，混匀并迅速加入0.5%OPT甲醇液0.1ml，立即混匀并在21～22℃反应10min，加0.5ml0.5N HCl酸化以终止反应，在日本岛津F-510型荧光分光光度计上波长440nm/360nm处测定荧光强度。
1.6 统计学方法 数据以均数±标准差（ˉx±s）表示，采用t检验，以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 肥大细胞染色及其计数结果 光学显微镜下见肥大细胞分布于正常皮肤真皮深层、皮肤与肉芽组织交界及肉芽组织毛细血管周围，呈椭圆形或长圆形，最大直径约20～30μm，细胞质内可见紫蓝色颗粒，其计数结果分别见表1、2。
表1 创缘组肥大细胞计数结果
注:与正常组比较 ˇˇ P<0.01，与模型组比较 ▲▲ P<0.01。表2同此。
表2 肉芽组织肥大细胞计数
由表1可知，造模后创缘肥大细胞先降低后升高，治疗组则无明显下降，治疗1天和治疗10天后，治疗组比模型组肥大细胞数量明显升高（P<0.01，P<0.01）。由表2可知，造模后1到7天，治疗组与模型组肉芽组织内的肥大细胞数量无明显差异，治疗10天后治疗组明显高于模型组（P<0.01，P<0.01）。
3 讨论
3.1 中医对创伤的认识及足三里穴的选择 薛己在《正体类要》中曰:“肢体损于外，则气血伤于内，营卫有所不贯，脏腑由之不和”，说明创伤对机体的影响不仅在于损伤的局部，而且会导致全身气血紊乱，脏腑功能失调。朱震亨在《丹溪纂要》中提出“治损伤妙在补气血”，启发后世补益气血，提高机体防御功能是促进创伤修复的重要环节。足三里属多气多血之阳明胃经，具有补益气血，通调经络的作用。有关针刺对实验性组织损伤的研究表明:针刺可缓解组织水肿，病理及超微结构显示针刺有促进损伤组织修复的作用 ［4］ ;单纯微量直流电刺激不仅可促进创伤局部伤口的愈合，而且对远隔部位亦有肯定疗效 ［5］ 。电针“足三里”集中了电刺激与穴位的双重功效，是本实验选穴的理论依据。
3.2 肥大细胞及其介质在创伤修复过程中的意义 创伤修复过程一般可分为渗出期、纤维修复期及瘢痕形成期，其中以纤维组织修复最具代表性。近年来研究发现:肥大细胞除参与变态反应性疾病外，与肿瘤发生、血管生长、纤维修复及生殖系统的周期性改变均有不同程度的关系。肥大细胞起源于表达CD 34 抗原的多能骨髓干细胞，存在于骨髓，分布于结缔组织内，但有集中于上皮下浅层附近、外周神经周围、血管和淋巴管附近的趋势，这种解剖学的分布使肥大细胞对有害刺激易发生反应。肥大细胞的功能主要是通过其释放的介质来实现的，主要包括:（1）组胺:已知组胺是体内储存组胺的主要场所，在快速生长的组织及损伤修复时，体内组氨酸脱羧酶（HDCO）活性升高，此时形成的组胺称为诱生性组胺（inducible histamine），该物质是游离型的，可在产生部位向周围组织自由弥散 ［6］ 。实验表明:肥大细胞分泌的组胺在体外能刺激成纤维细胞增殖和胶原合成 ［7］ ，肥大细胞颗粒能引起人微血管内皮细胞增生，而这种与刺激作用有关的可透析的颗粒因子正是组胺 ［8］ 。（2）肝素:肝素 可通过组织细胞参与对脂类的摄取并刺激毛细血管内皮细胞的移行，因而在血管生成中起主要作用 ［9］ 。（3）肿瘤坏死因子α（TNF-α）:研究发现，肥大细胞可产生TNF-α，刺激正常二倍体的成纤维细胞增生及肉芽组织基质粘多糖的形成 ［10］ ，同时，还是介导成纤维细胞胶原Ⅰ合成的介质 ［11］ 。此外，肥大细胞亦可释放多种细胞因子，如粒系-巨噬细胞集落刺激因子、IL-1、IL-6等，以上物质能刺激成纤维细胞增生和结缔组织生长 ［12］ 。
3.3 电针对肥大细胞数量的影响 以往研究发现:电针大鼠“足三里”，可促使肥大细胞脱颗粒释放组胺 ［13］ ，局部穴区肥大细胞呈现明显超微结构变化 ［14］ ，且在电针防治变态反应性疾病方面做了大量工作。本实验探讨了电针对创伤修复过程中肉芽组织及创缘肥大细胞数量的影响，结果显示:造模后创缘肥大细胞先降低后升高（P<0.01），而治疗组并无明显下降，与模型组比较差异有显著性（P<0.01），且在治疗10天后明显高于模型组（P<0.01），说明针刺可通过减少创伤初期肥大细胞由创缘向创面转移，从而减轻炎症反应。同时创伤修复过程中，治疗组肥大细胞多于模型组（P<0.01），有利于成纤维细胞合成胶原及新生毛细血管的形成。肉芽组织内肥大细胞计数结果表明:创伤初期模型组与治疗组肉芽组织内的肥大细胞无差异，经治疗10天、15天后，二者差异均有显著性（P<0.01，P<0.01），提示针刺在增加创缘肥大细胞的同时亦可使创面肥大细胞增加，电针作用有一定的时效性，其对肉芽组织的影响主要表现在纤维修复期。
3.4 电针对组胺含量的影响 电针不仅可引起正常机体穴区局部肥大细胞释放组胺，在远离针刺部位的组织亦呈现相同的效应。曾经有人在大鼠背部皮肤做切口，观察尿中组胺含量，发现第5天达高峰，而伤口愈合后，组胺含量亦恢复正常 ［6］ 。本实验选取肉芽组织进行组织中组胺含量测定，目的在于直接探讨电针对创伤局部组胺含量的影响，结果显示:造模后第3天组胺含量升高（P<0.05），而此时炎症反应已基本控制，纤维修复已开始并逐渐加强，随着肉芽组织的生长，造模10天、15天后组胺含量仍持续升高（P<0.05，P<0.01），且有增长趋势，可能与局部肥大细胞持续分泌组胺使其浓度增长有关。本实验中针刺对组胺的影响主要在造模后第3天，与造模后引起肥大细胞数量增加是一致的，故认为在纤维修复的启动阶段肥大细胞及其分泌的组胺起了主要作用，而以后治疗组仅见肥大细胞数量增加，组胺含量与模型组无明显差异，是否与肥大细胞在不同的阶段分泌的介质不同有关（如创伤初期以分泌组胺为主，而后改为以分泌TNF-α、IL-1等），有待今后进一步探讨。
参考文献
1 杨金英，吴跃进，陈志东，等.创伤愈合实验动物模型的建立及实验方法