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关键词 葛根素 脂质过氧化
Key words Puerarin I/R myocardium free-radicals lipid peroxidation
近年来随着国内外学者对I/R损伤的深入研究,一致认为氧自由基及其脂质过氧化毒性反应与心肌I/R损伤有密切关系 [1] 。因此,为寻求有效的抗氧化剂保护缺血心肌细胞,减轻脂质过氧化损伤,一直是缺血性心脏疾病研究的重要课题。众多的研究表明葛根素具有扩张冠脉血管、脑血管和改善微循环的作用,还通过抗血小板聚集,促进内皮细胞功能及调节血管活性物质和抗脂质过氧化反应,保护I/R心肌,减少梗死面积。在治疗心血管疾病方面具有确切的疗效 [2] 。为进一步探讨葛根素保护心肌的分子机制,我们采用体外培养的心肌细胞,建立I/R损伤模型,从细胞水平观察葛根素的抗心肌I/R损伤脂质过氧化毒性反应。深入探讨葛根素对心肌细胞保护作用的确切机制,为临床应用提供新的理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.药品和试剂 葛根素注射液又名麦普宁注射液(山东省瑞阳制药有限公司)。LDH、MDA、SOD、NO试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
1.1.2 动物 新生SD大鼠由四川大学实验动物中心提供。
1.2 方法
1.2.1 心肌细胞原代培养 细胞培养参照文献方法进行 [3]
1.2.2 缺血再灌注损伤模型 参照文献配制模拟缺血再灌注液(mmol/L),并建立缺血再灌注损伤模型 [4,5] 。模拟缺血:将常规心肌细胞培养液换成模拟缺血液后,把培养板放入厌氧罐中,充入95%N 2 +5%CO 2 持续40min以驱除瓶内O 2 ,37°C密闭培养2h;模拟再灌注:将缺氧的心肌细胞换用模拟再灌注液常规培养1h。
1.2.3 药物浓度筛选 葛根素的浓度通过预实验以LDH为筛选指标选定。
1.2.4 实验分组与方法 将原代培养的心肌细胞分为10 组,①正常对照组;②正常+Pur(0.1g/L)对照组;③缺血对照组;④缺血+Pur1(0.01g/L);⑤缺血+Pur2(0.1g/L);⑥缺血+Pur3(1g/L)、⑦缺血再灌注对照组;⑧再灌+Pur1;⑨再灌+Pur2;⑩再灌+Pur3。各药物浓度组实验前在培养基中加入Pur预处理24h,再按前述方法建立I/R损伤模型。实验结束收集各组培养液行后续指标检测。
1.2.5 检测指标及方法 分别取各组培养液送生化室行NO、NOS、LDH、MDA及SOD检测。检测方法严格按照试剂盒说明书进行。
1.2.6 统计分析 实验数据以平均值标准差(ˉx±s)表示,两组间比较用t检验,多组间比较用完全随机设计方差分析及多重比较。
2 结果和分析
2.1 Pur对NO,NOS,LDH,SOD,MDA含量的影响 结果见表1。
表1 Pur对NO,NOS,LDH,SOD,MDA含量的影响(略)
注:与正常对照组比较 △ P>0.05, ˇˇ P<0.05
2.2 缺血各组方差分析及多重比较结果 结果见表2。
表2 缺血各组方差分析及多重比较结果(略)
2.3 再灌注各组方差分析及多重比较结果 结果见表3。
表3 再灌注各组方差分析及多重比较结果(略)
3 讨论
氧自由基大量产生是目前公认的I/R损伤的主要机制之一 [6] 。氧自由基主要通过一系列的过氧化反应造成组织细胞的损伤,其中主要的损害为细胞膜磷脂分子中不饱和脂肪酸的过氧化,产生脂质过氧化物,再经过氧化物酶分解生成MDA(MDA是细胞内脂质过氧化反应的终产物,是反映体内氧自由基活性的重要指标之一,其含量的高低常常可反映细胞内脂质过氧化的程度,间接地反应出细胞损伤的程度),最终使磷脂结构发生变化,生物膜受到严重损害 [7] 。我们的研究也发现,当心肌细胞遭遇缺血和缺血再灌注时MDA大量生成,同时伴有心肌细胞的严重损伤,表现为细胞膜通透性增加,LDH漏出增多。在我们同期的实验中还发现细胞内钙离子超载,电子显微镜观察到细胞凋亡的形态学特征。自由基反应的最大特点是连锁反应,当胞内Ca 2+ 超载时,激活了Ca 2+ 依赖性蛋白酶,诱导黄嘌呤—黄嘌呤氧化酶系统大量产生氧自由基。再灌注时,因缺血而损伤的细胞不能完全利用氧,多余的氧被单电子还原成负氧离子(O -2 )、过氧化氢(H 2 O 2 )等,随着细胞内氧的大量涌入,氧自由基呈爆发性增加。由于缺血心肌细胞中氧自由基清除酶的活性与抗氧化物含量减少,使得自由基生成与清除的平衡严重失调,大量自由基堆积作用于心肌细胞膜及细胞器,发生脂质过氧化毒性作用,损伤细胞的结构、代谢与功能 [1] 。活性氮是自由基领域中的又一个新的研究前沿,主要包括一氧化氮(NO)和二氧化氮(NO 2 )。近年来NO在心血管、免疫、神经系统等的作用引起了人们的广泛关注。NO是一种具有多重生物学效应气体分子,其生物学效应具有多样性和复杂性,NO作为信号分子介导着机体多个系统的生理活动,但它又具有细胞毒性并中介一些病理过程 [7] 。我们的实验还发现在I/R过程中NOS活性升高,NO含量增多。NO能迅速与超氧阴离子自由基结合生成过氧化亚硝酸盐而导致心肌细胞损伤 [8] 。
葛根为豆科多年生落叶藤本植物野葛或干葛的根。分布于我国南北各地。性味甘、辛,凉。归脾、胃经。葛根素是从野葛的干燥根中提取的一种异黄酮类化合物,有明显扩张冠脉血管、脑血管和改善微循环的作用,还通过抗血小板聚集,促进内皮细胞功能及调节血管活性物质,还能改善正常和缺血心肌的代谢,明显降低缺血引起的心肌乳酸的产生,降低I/R时心肌的氧耗量,保护I/R心肌。除此之外葛根素还具有清除自由基、抗脂质过氧化反应。在治疗心绞痛、心肌梗死、脑梗塞方面有确切疗效。因此葛根素具有良好的心脑血管保护作用 [2] 。我们的实验用现代研究手段从细胞水平评价葛根素对心肌细胞的保护作用,结果表明经Pur预处理后再行缺血和缺血再灌注,各浓度组均可使上述指标明显逆转,并显示出一定的浓度依赖性。提示在一定浓度范围内葛根素均能对抗自由基的产生,减少SOD消耗,使得自由基产生与清除的平衡得以维持;还可抑制心肌I/R时NOS活力而减少NO的合成,减轻氧自由基和一氧化氮自由基介导的脂质过氧化毒性反应对心肌细胞的损害,增强心肌的抗氧化能力。这可能是Pur保护心肌缺血再灌注损伤的重要机制之一。
参考文献
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(收稿日期:2004-06-12)
ˇ 基金项目:四川省卫生厅科学研究课题(No.030104)
作者单位:610041四川省卫生干部管理学院
610041四川大学华西医院医学遗传研究室
四川大学基础与法医学院生理教研室
(编辑一坤)