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【摘要】 目的 研究惊厥大鼠外周血淋巴细胞早期凋亡率的变化。方法 在Wistar大鼠腹腔内注射马桑内酯诱发大鼠惊厥发作，制作癫痫模型。将30只Wistar大鼠随机分为二组，A组:致痫组15只，B组:生理盐水组15只。采用流式细胞仪检测A、B组惊厥前、惊厥后6h、12h、24h外周血淋巴细胞早期凋亡率的变化。结果 惊厥大鼠外周血淋巴细胞凋亡率低于惊厥前及给予生理盐水组大鼠外周血淋巴细胞凋亡率。惊厥后6h即可见外周血淋巴细胞凋亡率下降，并逐渐减少，在24h凋亡率最少。在惊厥前、惊厥后6h、12h、24h不同时间点两两比较差异有显著性P<0.01）。结论 大鼠惊厥后其外周血淋巴细胞凋亡率降低，以进一步证实癫痫的免疫学机制。
关键词 癫痫 凋亡 淋巴细胞 大鼠
Study about early apoptotic lymphocyte in peripheral blood of convulsion rat
Wu Chunyan，Hu Mengying，Zhang Aiqi，et al.
Department of Pediatrics，The Sencond Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin150086.
【Abstract】 Objective To explore the changes of early apoptotic lymphocyte in peripheral blood of convulsion rats.Methods The epilepsy model was established by injecting coriaria lactone（CL）into Wistar rats to induce the generalize
d seizures.Thirty rats were randomly divided into2groups.Groups A:epilepsy15;groups B:normal saline（NS）15.The change of the percentage of early apoptotic lymphocyte in peripheral blood was detected with flow cytometry at6h，12h and24h before and after the rats got seizure.Results The percentage of apoptotic lymphocyte of convulsion rats was lower than that of before convulsion rats and B group.The reduction of the percentage of apoptotic lymphocyte was detected after convulsion6h，lowest at24h，the differences existed between the groups at according time（P<0.01）.Conclusion The percentage of apoptotic lymphocyte in peripheral blood reduced after convulsion.
Key words epilepsy apoptosis lymphocyte rat
癫痫是由不同病因引起的脑功能障碍性疾病。自1969年Walker首次提出癫痫免疫学发病假说以来，许多临床研究发现部分癫痫病人存在免疫功能异常。近年来大多数学者认为神经免疫调节网络失衡参与了癫痫的发病过程。在复杂的神经网络中，神经系统与免疫系统存在双向调节作用，前者通过产生多种神经调质调节免疫功能，后者通过产生细胞因子等免疫活性物质调节神经功能 ［1］ 。在癫痫过程中国内外学者的共识是由于兴奋性氨基酸的兴奋毒作用以及细胞内钙超载等作用神经细胞出现细胞凋亡。但有关癫痫与外周血淋巴细胞凋亡的关系尚无报道。为此我们通过流式细胞技术研究致痫大鼠外周血淋巴细胞早期凋亡的变化，以进一步讨论癫痫的免疫学机制。
1 材料与方法
1.1 动物分组 健康成年Wistar大鼠30只，体重200～250g，雌雄各半，由哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验中心提供。动物随机分为两组:A组:马桑内酯致痫组15只，B组:生理盐水组15只。
1.2 动物模型及实验方法 马桑内酯（由哈尔滨医科大学药理学部提供）A组按1.5mg/kg腹腔注射，全部大鼠于注射后5min左右出现抽搐，持续时间1min。B组腹腔注射等量的生理盐水。全部大鼠均于致痫前、致痫后6h、12h、24h予以戊巴比妥钠麻醉（1%，40mg/kg，腹腔注射），经股静脉抽出1ml静脉血放入抗凝管中。
1.3 流式细胞术检测淋巴细胞早期凋亡 抗凝外周血1ml用冷PBS3倍稀释，加入淋巴细胞分离液面上，2000r/min，离心15min，吸取单个核细胞层。冷PBS洗涤，1000r/min，离心5min弃血清;加入Buffer调细胞浓度为（2～5）×10 6 /ml;吸取50μl细胞悬液加Annexin-V，PI5μl（Annexin-V，PI试剂盒由北京宝赛生物技术公司提供），避光，室温25min，FACSort流式细胞仪（美国BD公司出品）检测，结果采用ELLQUEST3.0软件分析。
1.4 统计学处理 各组间及组内比较采用方差分析，结果以均值±标准差（ˉx±s）表示。
2 结果
2.1 流式细胞仪检测外周血早期凋亡淋巴细胞 Annexin V能与早期凋亡细胞的磷脂酰丝氨酸高亲和力特异性结合，而PI染色能够红染凋亡晚期的细胞和死细胞得以从中区别开来。结果见图1。根据阴性对照所设定的荧光正常界限，将淋巴细胞分为正常活细胞（荧光双阴性细胞，左下象限）、早期凋亡细胞［Annexin V（+），PI（-），右下象限］及死细胞［Annexin V（+），PI（+），右下象限］。利用CELˉLQUEST软件进行参数获取和数据分析结果。图1 早期凋亡细胞二维散点图
2.2 各组大鼠外周血淋巴细胞凋亡率 A组癫痫发作后6h即可见凋亡细胞数改变，较癫痫发作前凋亡细胞数减少，两个时间点相比较差异有显著性（P<0.01）。在12h及24h其凋亡细胞数逐渐减少，在不同时间点组内两两比较差异有显著性（P<0.01）。B组凋亡细胞数在致痫前与致痫后各时间点相比较差异无显著性（P>0.05）。见表1。
表1 惊厥发作前后大鼠外周血淋巴细胞凋亡率 (略)
3 讨论
癫痫是一种严重危害人类健康的神经系统疾病，由反复发作的大脑神经元异常放电所致的短暂性脑功能失调。但长期以来对其发病机制的研究未取得突破性进展。自从Walker ［2］ 于1969年提出了免疫学发病假说后，随着免疫学的不断深入研究，人们对癫痫免疫学理论的研究也日趋完善，提出了癫痫体液免疫、细胞免疫及神经免疫内分泌学说。本实验对惊厥大鼠外周血淋巴细胞凋亡进行研究，进一步探讨癫痫的免疫学机制。
细胞凋亡又称程序性死亡，是机体基本生理功能，存在于生命的全过程，是维持机体正常生理功能和自身稳定的重要机制，生理状态下的凋亡在病理状态下的加剧是促使某些疾病进一步发生、发展的重要因素 ［3］ 。原癌基因、细胞因子、细胞间相互接触和细胞内信号传递等多种因素参与了凋亡的调控。
目前国内外检测细胞凋亡有多种方法，利用流式细胞技术检测早期淋巴细胞凋亡的AnnexinV和PI双标记法 ［4］是一种比较新颖的方法，具有速度快、精度高、准确性好的 特点，目前广泛用于细胞凋亡的检测。在细胞凋亡早期，磷脂酰丝氨酸从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中，而PI是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡晚期的细胞和死细胞，PI能够透过而使其红染。因而将AnnexinV和PI匹配使用，就可以将凋亡早期细胞和晚期细胞以及死细胞区分开来。因此AnnexinV可以及早地检测到早期凋亡细胞。我们应用该方法对A组马桑内酯致痫大鼠致痫前、致痫后6h、12h、24h外周血早期淋巴细胞凋亡进行检测，其结果是致痫后6h外周血凋亡细胞已可见减少，之后逐渐减少，到24h凋亡细胞显著减少，不同时间点相比较差异有显著性（P<0.01），B组给予生理盐水组大鼠在给药后6h、12h、24h与
给药前相比较无明显改变，经统计学处理差异无显著性（P>0.05），表明癫痫后6h即早期已有外周血淋巴细胞凋亡，到24h淋巴细胞凋亡数仍有变化，说明癫痫后早期外周血淋巴细胞凋亡在淋巴细胞的发育和癫痫免疫调节中发挥重要作用。在癫痫发作时淋巴细胞抑制凋亡基因活性增强，淋巴细胞bc1-2基因过度表达，可能通过抑制或延迟细胞凋亡，促进多克隆B细胞增强，从而产生大量自身抗脑抗体如抗神经节苷脂抗体、谷氨酸受体自身抗体、谷氨酸脱羧酶自身抗体等，这些抗体引起癫痫的发生和发展。另外，刘智胜 ［5］ 等研究发现癫痫患儿血清IL-2、TNF-α和IFN-α水平明显高于正常对照组儿童，表明癫痫患儿体内免疫细胞处于活化状态，细胞因子IL-α、TNF-α和IFN-α参与了异常免疫应答，进一步参与了癫痫的放电过程，而这些细胞因子具有抑制外周血淋巴细胞凋亡作用。本项研究结果初步揭示了癫痫的免疫学机制，为临床上调整免疫状态而治疗癫痫的机制提供理论依据。我们相信随着科技的发展，癫痫的神经免疫学机制将进一步得到阐明。
参考文献
1 MaroderM，Bellavia D，Vacca A，et al.The thymus at the crossroad of neuroimmune interaction.Ann N Y Acad Sci，2000，917:741-747.
2 Walker AE.Allergic phenomena as basic mechanism in epilepsy.In:Jasper HH，ward AA，Pope A，eds.Basic me
chanisms of the epilepˉsies.London:Churchill，1969，812-819.
3 Bonfoco E，Krainc D，Ankarcrona M，et al.Apoptosis and necrosis:two distinct elents induced，respectively，by mild and intense insults with N-methy1-D-aspartate or nitric oxide/superoxide in cortical cell cultures.Proc Natl Acasci USA，1995，92:7126-7134.
4 Bergamo A，Batailleiz，Pellat deceungnck C.CD40and CD95induce programmed cell death in the human myeloma cell line XG2.Br J Haematol，1997，97（3）:652.
5 刘智胜，杨立志，王芳琳，等.癫痫患儿的血清细胞因子水平变化及意义.中国神经免疫学和神经病学杂志，2002，9（3）:132-134.
（收稿日期:2004-04-11） （编辑日 强）
作者单位:163001黑龙江大庆大庆油田总医院儿科
150086黑龙江哈尔滨医科大学附属第二医院儿内科