槲皮素抑制热休克诱导肝癌HepG2细胞HSP70的表达

     【摘要】 目的 研究热休克诱导肝癌HepG2细胞HSP70的表达规律及槲皮素对HSP70表达的抑制效应，为中医中药治疗肝癌和提高肝癌热疗效果提供了理论依据。方法 （1）体外培养肝癌HepG2细胞，恒温水浴42℃热休克HepG2细胞90min。（2）采用免疫细胞化学法、流式细胞术检测热休克前、热休克后2h、4h、8h、12h、24h时HSP70的表达规律;热休克前1h应用槲皮素对HSP70的抑制效应;热体克后应用槲皮素对HSP70的抑制效应。结果 （1）42℃热休克诱导HepG2细胞，HSP70表达增多，阳性细胞数升高，4h达到最高（11.47%），8h后回落到低值。（2）热休克前应用槲皮素能有效抑制热休克诱导HSP70的过量表达。（3）热休克后加入槲皮素，对已诱导产生的HSP70无明显抑制作用。结论 热休克能诱导肝癌HepG2细胞的HSP70过量表达，热休克前应用槲皮素能抑制人肝癌HepG2细胞HSP70的过量表达，提示桷皮素可作为一种热疗的增敏剂。

    关键词 槲皮素 HepG2细胞 热疗 热休克蛋白70

     A study of the inhibition effect of Quercetin on  HSP70of HepG2cells induced by heat shock   Zeng Wenting，Tang Wubing，Ma Peiqiu，et al. Department of Hepatology Research，First Affilliated

     Hospital of Guangzhou Medical College，Guangzhou510120

    【Abstract】 Objective To study the expressions of heat shock protein70（HSP70）in human heptocarcinoma cell line HepG2after hyperthermia and the inhibition effect of Quercetin on HSP70expresses.It will provide practical and theoretical foundation for clinical hyperthermia and traditional Chinese medicine on liver cancer.Methods （1）HepG2cells were cultured in vitro.HepG2cells were heat shocked being bathed in water at42℃stably for90min.（2）Immunocytochemistry and flow cytometry（FCM）were used.The expressions of HSP70were detected at0hour before and2，4，8，12，24hour after heat shock.Quercetin were applied to an hour before heat shock and after heat shock.Then the expressions of HSP70were detected to observe the inhibition effect of Quercetin.Results （1）HSP70overexpresses after HepG2cells are shocked at42℃.The percentage of HSP70positive cells comes to a climax（11.47%）at4h.At8h after heat shock，it delines to a lower degree.（2）The overexpressions of HSP70can be inhibitˉed effectively when Quercetin is used at1h before heat shock.（3）The overexpressions of HSP70can not be inhibited effectively when Quercetin is used after heat shock.Conclusion Heat shock is possible to induce The overexpressions of HSP70in HepG2cells.The overexpressions of HSP70can be inhibited effectively when Quercetin is used before heat shock.Quercetin is possible to be a sensitize hyperthermia chemical.

    Key words Quercetin HepG2cell hyperthermia heat shock protein70   槲皮素（Quercetin，Qu）广泛分布于水果、蔬菜等植物界，具有较为广泛的生物学效应，近年研究表明其具有抗肿瘤活性。热疗是目前中晚期肝癌常用的治疗方法之一，但由于多种原因，肝癌细胞易产生热耐受，热休克蛋白HSP70的过量表达是常见的原因之一，为探讨槲皮素对HSP70表达的抑制效应，进行了下列研究。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 细胞 人肝癌传代细胞系HepG2细胞。

    1.1.2 主要试剂 鼠抗人单抗HSP70（Neo Markers产品）、羊抗小鼠IgC二抗ABC试剂盒DAB显色剂（Boster公司）、羊抗小鼠IgG-FITC（Sigma公司产品）、RPMI1640培养液（Gibco产品）;槲皮素（Sigma公司产品，晶美公司提供）。

    1.1.3 主要仪器 电热恒温水浴箱、CO 2 培养箱、超净工作台、多功能显微镜、倒置式显微镜、流式细胞仪（FCM）等。

    1.2 方法

    1.2.1 细胞培养 HepG2细胞常规培养于RPMI1640中，加入10%小牛血清，青霉素（10万U/L）、链霉素（100mg/L），单层培养于37℃含5%CO 2 恒温培养箱内。用接种传代第3日的细胞做实验，0.125%胰蛋白酶-0.01%EDTA消化，计数，调整适当浓度进行实验。

    1.2.2 热休克方法 将适当浓度的对数生长期细胞种植在培养瓶或培养板中37℃培养24h以便细胞贴壁;再换37℃新鲜培养液，密封，浸于42℃恒温水浴中90min;置于37℃含5%CO 2 恒温孵育箱内培养0h、2h、4h、8h、12h、24h。

    1.2.3 槲皮素处理 将适当浓度的对数生长期细胞种植在培养瓶或培养板中，37℃培养24h。（1）对照组1:不加槲皮素，只换新鲜培养液37℃培养;（2）对照组2:换含不同浓度槲皮素（100、200μM/L）的培养液37℃培养共同培养24h（3）热疗组1:在42℃恒温水浴热疗前1h换新的含不同浓度槲皮素（50、100、150、200μM/L）的培养液共同培养，42℃恒温水浴热疗90min，37℃含5%CO 2 恒温培养箱内培养4h;（4）热疗组2:在热疗42℃恒温水浴热疗90min后，换新的含不同浓度槲皮素（0、100μM/L）的培养液37℃共同培养4h。

    1.2.4 免疫组化测定HSP70表达 于6孔板加入无菌盖玻片，每孔加入3ml细胞数为3×10 4 /ml的培养液，培养24h后行加温或加药处理，根据不同时间，取出小玻片，蒸馏水漂洗1次。风干后用纯丙酮固定20～30min，0.1M PBS液5min×1次;然后用0.5%的H 2 O 2 -甲醇溶液室温浸泡30min，0.1M PBS液洗5min×3次。滴加正常山羊血清封闭液50μl，室温20min;每片滴加50μl鼠抗人单抗HSP70（1:200），室温湿盒孵育30～60min，以PBS液代替一抗作为对照组;0.1M PBS洗5min×3次后，滴加生物素化的第二抗体山羊抗小鼠IgG，室温湿盒孵育20min;0.1M PBS洗2min×3次;滴加ABC复合物试液，室温湿盒孵育30min;0.1M PBS洗5min×4次;DAB显色切片;取1ml蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各1滴混匀，滴50μl/片，室温显色30～60s，镜下控制染色，每块片同等时间显色;蒸馏水充分洗涤以终止反应。以苏木精轻度复染，0.5%盐酸-70%乙醇分化30s;流水返蓝30min，无水乙醇脱水5min×2次，二甲苯透明5min×1次，中性树脂封片。显微镜下观察，摄像。

    1.2.5 流式细胞术检测HSP70阳性细胞数量表达 将适当浓度的对数生长期细胞种植在50ml培养瓶中，37℃培养24h。按上述方案加温，加药，消化细胞，制成细胞悬液。1%多聚甲醛固定过夜;1000r/min离心5min，去上清液;PBS洗涤1次;PBS重悬细胞，调整细胞浓度不小于1×10 6 /ml;每组分2管:A管:阴性对照管;B管:测HSP70管。每管取100μl细胞悬液加在10ml玻璃离心管中;A管加入阴性对照试剂鼠抗人IgG-FITC、鼠抗人IgG-PE各10μl;B管加入鼠抗人单克隆抗体（1:100）10μl;4℃冰箱中避光1h。PBS液充分洗涤;1000r/min离心5min，去上清液;A管加入450μl PBS液重悬;B管加入100μl PBS液重悬，加入羊抗小鼠IgG-FITC10μl（1:100），4℃冰箱中避光1h，1000r/min离心5min，PBS液充分洗涤，离心，450μl PBS液重悬，上FCM机检测。

    2 结果

    2.1 免疫组织化学法检测HSP70的表达

    2.1.1 热休克诱导HSP70的表达 镜下观察热休克前肝癌HepG2细胞有HSP70的表达，以细胞质为主，呈淡黄色着染，部分瞎胞核淡染，核仁无染色;热休克后HSP70表达增多，4h达高峰，核仁着染，核仁和细胞核、细胞质均呈深褐色着染;8h后逐渐减少，24h时核仁无染色，仍以细胞质淡黄色着染为主，少部分细胞核淡黄色着染，HSP70表达基本恢复到热休克前水平以下。

    2.1.2 槲皮素抑制HSP70的表达 对照组1见细胞质内少量HSP70表达，呈淡黄色着染，细胞核内未见有表达;对照组2中100μM/L、200μM/L Qu组细胞质内浅黄色着染，细胞核无着染。热疗组1细胞质内HSP70表达，呈黄褐色着染，颜色随Qu浓度增高逐渐变淡，细胞核内未见有表达，以 200μM/L Qu组效果明显;热疗组2见细胞质内HSP70表 达，呈黄褐色着染，部分细胞核内表达。

    2.1.3 流式细胞仪检测HSP70阳性细胞表达率

    （1）热休克诱导HepG2细胞HSP70随时间的表达:HepG2细胞42℃热休克90min后，37℃恒温孵育箱内0h、2h、4h、8h、12h、24h培养，HSP70在2h时逐渐升高，4h时达高峰，8h后逐渐回落至低值（见表1）。

    表1 FCM检测热休克诱导HepG2细胞HSP70阳性细胞时间表达规律（略）

    表2 FCM检测槲皮素抑制HepG2热休克HSP70阳性细胞表达率 Qu0μM/L（略）

    注:不同浓度的槲皮素在42℃热休克1h前加入，42℃热休克90min，37℃恒温培养箱中再培育4h   （4）在热疗组2中，42℃恒温水浴热疗90min后，换新的含不同浓度槲皮素（0、100μM/L）的培养液37℃共同培养4h，HSP70阳性细胞表达率分别为11.47%和9.13%，加槲皮素不能显著减少HSP70阳性细胞表达率。

    3 讨论

    热疗单用或联合化疗等方法被认为是治疗肿瘤行之有效的方法，研究表明高温治疗肿瘤是通过凋亡机制杀伤肿瘤细胞，肿瘤细胞对热疗的内在敏感性可能是决定热疗效应及影响热疗成败的一个关键因素。热休克能诱导HSP70过量表达，是肿瘤热疗后继续治疗的一大障碍。目前已比较明确与热疗相关的基因与蛋白有热休克蛋白（HSP）。HSP是一类高度保守的蛋白质，在受热或其它应激性刺激时合成增加。其在热休克蛋白家族中最为重要，具有“分子伴侣”功能，在机体其它蛋白质的生物合成和细胞运输过程中起着必不可少的作用。哺乳动物在正常情况下很难测出HSP70，但在应激状态下HSP70会大量合成。肿瘤细胞在热疗、化疗等应激条件下可激活热休克因子（HSF），使热休克蛋白（HSP），尤其HSP70产生增多 ［1］  。目前已有许多报道证实恶性肿瘤细胞常常高表达HSP70，并且在体内外许多不利于肿瘤细胞生长的环境中具有保护作用，尤其是热刺激时，而对正常细胞则无此作用。近年来，Qu的抗肿瘤活性日益受到重视，它不仅对各种致癌剂、促癌剂有拮抗作用，具有化学预防作用，而且可以通过抑制多类恶性肿瘤细胞的增殖、抑制血管形成、诱导分化及凋亡等来发挥抗肿瘤作用。Larocca ［2］  研究发现Qu对白血病细胞有促凋亡作用，且呈剂量效应，联合热疗能抑制诱发的HSP70表达，显著增强了单用Qu或热疗所产生的抗白血病效应，且对正常造血干细胞无不良影响。王小平等 ［3］  把不同人肝癌细胞经42℃休克2h，结果显示热休克前后不同人肝癌细胞中HSP70表达均明显增加，在16h达高峰，分化较差的肝癌细胞SMMC-7721、HHCC、HCC-9724表达程度较强，而分化较好的肝癌细胞HCC-9204、HepG2细胞HSP70的表达较弱。本实验采用细胞免疫组化法观察到热应激前后HSP70在细胞中表达的变化，流式细胞术观察热应激前后HSP70阳性表达率。在未应激细胞中，HSP70表达较少，只在细胞质中少许表达;HSP70阳性细胞率0.16%。在热应激细胞中，细胞质、细胞核、核仁中HSP70表达增多，有核内迁移现象，4h达到高峰，阳性率为11.47%，8h后开始回落。本实验发现用槲皮素在热疗前1h处理HepG2细胞，热休克后4h应用免疫组化法和流式细胞术检测HSP70的表达，HepG2细胞的HSP70阳性表达率明显降低，以100μM/L～200μM/L明显，其抑制效应明显，呈明显的浓度效应。而槲皮素在细胞热休克后才加入到培养液中，对已诱导产生的HSP70无明显抑制作用，这提示槲皮素可能是在转录水平上抑制HepG2细胞产生HSP70。国外近期研究也有类似报道，Hansen ［4］  认为槲皮素抑制乳腺癌细胞HSP70表达可能 是通过调节热休克蛋白的转录因子（HSF）的转录活性而起作用，而不是通过调节HSF与DNA的结合能力。

    本实验从体外研究中发现热休克能诱导人肝癌HepG2细胞的HSP70过量表达，槲皮素能抑制人肝癌HepG2细胞热诱导HSP70的过量表达，可作为肝癌热疗的增敏剂。本研究为中医中药治疗肝癌提供了新的依据，经进一步动物实验和临床研究，可把槲皮素开发成新的抗肿瘤药物，为肝癌综合治疗提供一种新思路、新方法。

    参考文献

     1 Hever Szabo A，Pirity M，Szathmari-M，et al.P-plycoprotein is overˉexpressed and functional in severely heat-shocked hepatoma cells.Anˉticancer-Res，1998，18（4C）:3045-3048.

    2 Luigi M，Larocca，Francoo，et al.Diffential sensitivity of leukemic and normal hematopietic progenitors to the killing effect of hyperthermia and quercetin used in combination:Role of heat shock proteins-70.Int J Cancer.1997，73:75-83.

    3 王小平，刘彦仿，杨守京，等.不同人肝癌细胞热休克蛋白70表达的动态研究.肿瘤研究与临床，2000，12（5）:294-295.

    4 Hansen RK，Qesterreich S，Lmiewx P，et al.Quercetin inhibits hsp inˉduction but not hsF DNA-binding in human breat carcinoma cell.Bioˉchemical and biophysical research comunitions，1997，239:851.

     作者单位:510120广州医学院第一附属医院肝病研究室