点击显示 收起
【摘要】 目的 本研究通过缩窄兔的腹主动脉建立压力负荷过重心衰动物模型，腹主动脉横截面积缩窄至原来的30%左右。在此基础上研究养心康阻抑心肌细胞凋亡的发生。 方法 纯种新西兰兔40只分成5组:（1）养心康高剂量组;（2）养心康低剂量组;（3）心宝组;（4）对照组;（5）空白组。每组新西兰兔各8只。通过细胞凋亡检测方法，探讨养心康对心衰动物模型的药效学作用及其抗心衰机制。 结果 高剂量组、低剂量组、心宝组均能减缓心肌细胞凋亡百分比的升高，与高剂量组差异有非常显著性（P<0.01），低剂量组、心宝组差异有显著性（P<0.05），高剂量组与低剂量组、心宝组比较，差异有显著性（P<0.05）。 结论 提示养心康具有抗心衰的作用，能延缓心衰的发展，是治疗心衰有效的新型中药制剂。 关键词 充血性心力衰竭 中医药疗法 养心康 动物模型 兔 细胞凋亡
本文采用手术缩窄兔的腹主动脉建立心脏压力超负荷心衰动物模型，模拟心功能不全的状态，通过细胞凋亡检测方法，探讨养心康对心衰动物模型的药效学作用及其抗心衰机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 动物 纯种新西兰兔40只，体重2～2.5kg，雌雄各半，由广东省医学实验动物中心提供。
1.1.2 药物 养心康（广州中药一厂提供，主要由人参、黄芪、毛冬青等药组成。每片净重0.3g，含生药0.255g，成人用量为每次4片，tid）;心宝（汕头中药厂产品，主要由洋金花、鹿茸、人参等组成，60mg/粒）。
1.1.3 试剂 原位细胞凋亡试剂盒（德国宝灵曼公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 分组 （1）养心康高剂量组;（2）养心康低剂量组;（3）心宝组;（4）对照组;（5）空白组。每组新西兰兔各8只。
1.2.2 造模方法 术前禁食8h，肌注青霉素40万U，用1.5%戊巴比安钠（30mg/kg）耳缘静脉注入麻醉，仰位固定，无菌条件下，在腹正中线左旁开约1.5cm，从肋弓下缘作一向下长约10cm的切口，分离肌层，打开腹腔。在肾动脉分支稍上处找到腹主动脉并分离此动脉，用游标卡尺量取腹主动脉直径，再放置相应内径的自制银环，造成腹主动脉狭窄，使缩窄后横截面积约为原来的30%左右，关闭腹腔。术后3天内每天1次肌注青霉素40万U。除空白组的动物行假手术，开腹而不缩窄腹主动脉外，其余四组的动物均进行上述造模手术。
1.2.3 处理方法 术后第5天，即予胃管灌药，养心康高剂量组用养心康17片溶于蒸馏水15ml灌服;低剂组用4片溶于蒸馏水15ml灌服;心宝组用心宝丸1粒溶于蒸馏水15ml灌服;对照组和空白组灌服等量蒸馏水。以普通兔料喂养，动物房温度控制在18℃～22℃。
1.2.4 细胞凋亡的检测 采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（荧光素标记测定法）。方法按如下步骤进行:实验兔的心脏标本→石蜡包埋→5μm连续切片→常规脱蜡脱水→PBS洗2min×2次→01MSSC，微波，高火2min，低火10min→自然冷却→3%H 2 O 2 洗10min→PBS洗5min×3次→正常绵羊血清封闭，37℃，20min→末端核苷酸转移酶10×cone50μl，加入核苷酸（荧光素标记）反应液，1×cone550μl，37℃，2h→PBS洗5min×3次→POD（过氧辣根酶标记的抗荧光亲抗体），37℃，30min→PBS洗5min×3次→DAB显色10min→水洗→苏术素复染30s→返蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
2 结果与分析
2.1 腹主动脉缩窄程度 在动物尸解后，取出腹主动脉上的银环，在根据手术时测量的腹主动脉直径，计算该腹主动脉缩窄后实际横截面积与缩窄前横截面积的百分比。经统计处理，高剂量组缩窄范围是（31.08±1.09）%，对照组缩窄范围是（31.09±0.99）%，各组之间差异无显著性（P>0.05）。
2.2 一般情况 2天后各组动物皆恢复进食，约10天后可见对照组动物活动减少，进食减少，反应迟钝，其余各组变化不明显;约15天后，对照组动物呼吸频率增快，灌胃后尤甚;第17天对照组有2只动物死亡，解剖见其中一心脏增大，肺充血，胸腔积液约10ml，未见腹水;心宝组有1只动物灌药时误灌入肺死亡。
2.3 细胞凋亡
2.3.1 镜检 光镜下见对照组大量心肌细胞凋亡，空白组未见心肌细胞凋亡，高剂量组个别心肌细胞凋亡，低剂量组有少数细胞凋亡，心宝组中等数量心肌细胞凋亡。
2.3.2 镜下计数 在400倍光镜下作视野内凋亡细胞计数，取视野内凋亡细胞数与细胞总数的百分比值做统计处理，结果见表1。
表1 各组动物心肌细胞凋亡百分比比较 （略）
注:与空白组比较， △△ P<0.01;与对照组比较， ** P<0.01;与对照组比较， * P<0.05;与心宝组比较，★ P<0.05;与高剂组比较， # P<0.05
低剂量组与心宝组比较差异无显著性，说明造模手术引起心肌细胞凋亡百分比升高。造模组之间比较中，高剂量组、低剂量组、心宝组细胞凋亡百分比均低于对照组，与高剂量组差异有非常显著性（P<0.01），低剂量组、心宝组差异有显著性（P<0.05），说明高剂量组、低剂量组、心宝组均能减缓心肌细胞凋亡百分比的升高;高剂量组与低剂量组、心宝组比较，差异有显著性（P<0.05），提示这方面的作用高剂量组>低剂量组、心宝组;低剂量组与心宝组差异无显著性。
3 讨论
细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是细胞在基因活动指导下的主动性死亡 ［1］ 。在多种体液因子和细胞因子调节下，受累的细胞散在、单个发生。细胞核固缩，染色质密度增高，共聚集在核膜周边。DNA裂解为180～200bp及其倍数的寡核苷酸片段，胞浆固缩，胞膜内陷，将细胞分割为多个外有膜包裹，内有完整细胞器的小体，即凋亡小体，最后被巨噬细胞吞噬，而不发生炎症反应 ［2］ 。最近的研究表明，各种损伤如缺血及缺血再灌注、心梗、机械牵张和主动脉狭窄引起的压力超载，导致某些基因如C-myc、C-fos等表达增强，从而使心肌细胞凋亡发生。心肌细胞凋亡参与心衰的心肌重构，这是心衰发病学上的新观点 ［3］ 。在扩张型心肌病和缺血性心肌病的充血性心衰患者和动物中均已证实有心肌细胞凋亡。心肌细胞凋亡使心肌细胞数目减少，纤维化进行性加重，从而心功能不全进行性发展 ［4］ 。在分子水平减轻心衰时心肌肥厚的演变，修饰衰竭心肌的基因表达是未来心衰的治疗方向 ［5］ 。从表1可知，与空白组比较，对照组的心肌细胞凋亡百分比明显增大，说明心衰时心肌细胞凋亡加重。高剂量组、低剂量组、心宝组均能阻抑心衰时心肌细胞的死亡。养心康存在的量效关系，心宝与低剂量的养心康比较无差异。但心肌细胞凋亡是心衰的原因还是结果，是发病机制还是伴随现象，其重要性究竟如何，目前尚不明确。从分子水平上干扰或切断细胞凋亡过程或细胞凋亡调节过程，从而阻断心衰的发生、发展的某一环节达到治疗心衰的目的，这可能是养心康及心宝的抗心衰机制之一。至于是在哪个环节上起作用，还有待进一步研究。
参考文献
1 韩福生，细胞凋亡与心血管系统疾病.中国地方病学杂志，1996，15（6）:359.
2 罗义.心血管细胞中的细胞凋亡.中华内科杂志，1998，37（3）: 20.
3 方福德，罗静初.分子生物学前沿技术.北京:北京医科大学协和医科大学联合出版社，1998，162.
4 陆再英.充血性心力衰竭的病理生理研究进展.临床内科杂志，1991，8（1）:3.
5 魏向荣.细胞凋亡与心血管疾病，心血管病学进展.疾病手册，1998，25（1）:11.
（编辑田 雨）
作者单位:510800广东省广州市花都区人民医院心内科