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【摘要】 目的 探讨内镜臭氧水自动洗消机对微生物的杀灭效果。 方法 采用不锈钢片为载体，进行了定量杀灭枯草杆菌黑色变种芽孢的试验。 结果 洗消机生成的臭氧水含臭氧11.6mg/L。载体定量杀菌试验表明，按洗消机设定程序在工作槽内用臭氧水自动清洗12min，该杆菌芽孢的平均杀灭率为99.97%;在容器内用臭氧水流动浸泡30min，该杆菌芽孢的平均杀灭率为99.97%;在试管中用该机生成的臭氧水浸泡40min，该杆菌芽孢的平均杀灭率为73.86%。 结论 试验中不论用臭氧水自动清洗12min还是用臭氧水流动浸泡30min，该机生成的臭氧水杀灭枯草杆菌黑色变种芽孢的效果均良好。
关键词 内镜 臭氧水 枯草杆菌黑色变种芽孢 杀灭效果
Experimental observation on germicidal efficacy of automatic ozone water cleaning-disinfector for endoscopy
Guo Runxia，Lu Bo，Liu Xiuyan，et al.
Institute of Environmental Health and Related Product Safety，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing100021.
【Abstract】 Objective To study the germicidal efficacy of automatic ozone water cleaning-disinfector for en-doscopy.Methods The small pieces of stainless steel were used as carriers and the quantitative germicidal tests for Bacillus subtilis var.niger were carried out.Results The ozone water generated by cleaning-disinfector contained ozone11.6mg/L.The carrier quantitative germicidal tests showed that the contaminated carriers were washed auto-matically by ozone water in working trough according to the designed procedure of cleaning-disinfector at the stage of12min，the killing rate of that bacillus averaged99.97%.The contaminated carriers were soaked by flowing ozone water for30min in container，the killing rate of that bacillus averaged99.97%.The contaminated carriers had ex-posed to ozone water generated by cleaning-disinfector in test-tube for40min，the average killing rate of that bacillus was only73.86%.Conclusion Whether the carriers are washing by ozone water in working trough according to the designed procedure at stage of12min or soaking by flowing ozone water for30min in container，the germicidal efficacy of the ozone water generated by cleaning-disinfector for killing Bacillus subtilis var.niger is in a good state.
Key words endoscopy ozone water Bacillus subtilis var.niger germicidal efficacy
内镜属于重复使用的医疗器械，因其结构和附件复杂，对它进行清洗和消毒存在着一定的难度。内镜检查是侵入性的，如果消毒不彻底，可增加患者发生医源性感染的危险性。据报道，使用后的内镜在清洗消毒前的致病菌阳性率相当高，清洗消毒后仍可查出不少致病菌 ［1］ 。常用的内镜消毒剂有戊二醛、过氧乙酸、邻苯二醛等，但对臭氧水能否用作内镜杀菌剂，尚无定论 ［2］ 。目前，应用臭氧水对内镜进行消毒正在探索中。新产品“内镜臭氧水自动洗消机”（以下简称洗消机）的原理是:采用脉冲高压激发产生臭氧与自来水混合形成臭氧水，在工作槽内对内镜进行自动清洗和消毒。为了评价该机的洗消联合作用，对其杀菌效果进行了试验观察，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料 菌株:枯草杆菌黑色变种芽孢ATCC9372;培养基:普通营养琼脂;稀释液:1%蛋白胨的0.03mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）（pH7.2）;中和剂:0.3%硫代硫酸钠和0.1%吐温-80的0.03mol/L PBS;染菌载体:不锈钢片（直径1.5cm）。
1.2 方法
1.2.1 臭氧含量测定 洗消机按设定程序自动工作，取出产生的臭氧水待测。取10%碘化钾溶液20ml，加入碘量瓶中，加待测臭氧水100ml和2mol/L硫酸5ml，混匀。放暗处静置5min后，用硫代硫酸钠标准溶液滴定并计算臭氧含量。
1.2.2 菌悬液及菌片制备 将枯草杆菌黑色变种芽孢ATCC9372的第4代罗氏瓶培养物镜检，当芽孢形成率达95%以上时，用无菌蒸馏水洗下菌苔，经离心、过滤、断链等处理收集芽孢悬液，用稀释液制成所需浓度备用。取所需浓度的稀释悬液滴染不锈钢片，稍干后再滴染1次，干燥后即成染菌载体。
1.2.3 中和剂选择试验 试验菌为枯草杆菌黑色变种ATCC9372芽孢，按《消毒技术规范》要求设8组载体定量杀菌试验。当试验结果出现:第6、7、8组不长菌，第3、4、5组组间菌数相差不超过10%;第1组不长菌或菌数很少，第2组菌数超过100cfu/片时，为所选中和剂适宜。试验重复3次，结果一致者予以确认。取2个染菌载体，放入250ml容器中，置于该机工作槽内，连续通入由该机产生的臭氧水流动浸泡20min，取出试验样片分别放入含5ml PBS和5ml中和剂试管中，作用10min后，振打、混匀，用倾注法接种，于37℃温箱培养72h后计算结果（以下有关试验样片放入中和剂并接种均按此程序操作），作为中和剂选择试验的第1、2组。另取3个染菌载体，放入250ml容器内，连续通入相同流速的自来水流动浸泡20min，其余操作与上述相同，作为中和剂选择试验的第3、4、5组。
1.2.4 载体定量杀菌试验 （1）工作槽内臭氧水自动清洗杀菌试验:取2个染菌载体，固定在该机工作槽内，按该机设定程序启动6min、12min，通入臭氧水自动清洗;然后取出试验样片分别放入中和剂并接种。另取2个染菌载体，按上述相同的操作程序通入自来水自动清洗，作为该试验的阳性对照。同时，将染菌载体不经任何处理，直接放入中和剂并接种，作为初始污染菌数对照。（2）容器内臭氧水流动浸泡杀菌试验:取4个染菌载体，放入250ml容器中，置于该机工作槽内，连续通入由该机产生的臭氧水流动浸泡。人工操纵该机于10min、20min、30min和40min后，分别取出试验样片放入中和剂并接种。另取1个染菌载体，按上述相同的操作程序连续通入自来水流动浸泡40min，作为该试验的阳性对照。同时，将1个染菌载体放入250ml容器中，用无菌蒸馏水静止浸泡40min后取出，放入中和剂并接种，作为初始污染菌数对照。（3）试管中臭氧水杀菌试验:将4支装有染菌载体的试管，分别通入该机产生的臭氧水30ml立即拧紧塞盖，计时，作用10min、20min、30min和40min后，取试验样片放入中和剂并接种。另以无菌蒸馏水浸泡40min，作为该试验的阳性对照。
2 结果
2.1 臭氧水臭氧含量 经检测，洗消机生成的臭氧水臭氧含量为11.6mg/L。
2.2 中和剂选择试验 洗消机生成的臭氧水，经0.3%硫代硫酸钠和0.5%吐温-80的0.03mol/L PBS的中和剂作用5min，可有效中和溶液中和菌体表面残留的该消毒剂对枯草杆菌黑色变种芽孢的作用，且中和剂及其中和产物对枯草杆菌黑色变种芽孢及培养基无不良影响。3次重复试验平均值:第1组生长菌落数远少于第2组;第3、4、5组生长菌落数间误差为5.22%，第6、7、8组均无细菌生长，试验符合《消毒技术规范》规定的要求。结果见表1。
2.3 臭氧水自动清洗的杀灭效果 该试验的初始染菌载体菌落数为1.52×10 8 cfu/片，自来水自动清洗6min和12min的阳性对照平均菌落数分别为1.01×10 6 cfu/片和6.92×10 5 cfu/片。按洗消机设定的程序，臭氧水自动清洗6min和12min，对染菌载体的杀灭率效果，见表2。在该试验中，自来水自动清洗6min和12min的除菌效果分别为96.16%和99.13%，说明单纯自来水自动清洗的机械作用，同样可以起到一定的除菌效果，而联合臭氧水的杀菌作用则效果更佳。但经滤膜法检测清洗出水证明，在臭氧水自动清洗的出水中无细菌芽孢存活;相反，在自来水自动清洗的出水中可检出存活的细菌芽孢。
2.4 臭氧水流动浸泡的杀灭效果 染菌载体经臭氧水流动浸泡30min，平均杀灭率为99.97%。效果见表3。
表1 中和剂选择试验结果 （略）注:试验温度为19℃～21℃，结果为3次试验平均值，第6、7、8组均无细菌生长
表2 臭氧水自动清洗对枯草杆菌黑色变种芽孢的杀灭效果 （略）注:试验温度为16℃～18℃，结果为5次试验平均值
表3 臭氧水流动浸泡对枯草杆菌黑色变种芽孢的杀灭效果 （略）注:试验温度为16℃～18℃，结果为5次试验平均值，初始染菌载体菌落数为1.47×10 7 cfu/片
2.5 试管中臭氧水浸泡的杀灭效果 该实验的无菌蒸馏水浸泡（1.39×10 6 ～2.22×10 6 cfu/片）。洗消机生成的臭氧水，在试管中对染菌载体浸泡作用的结果，见表4。
表4 试管中臭氧水浸泡对枯草杆菌黑色变种芽孢的杀灭效果 （略）注:试验温度为16℃～18℃，结果为5次试验平均值，平均对照菌落数为1.82×10 6 cfu/片
3 讨论
结果表明，洗消机生成的臭氧水含臭氧11.6mg/L。对枯草杆菌黑色变种芽孢进行载体定量杀菌试验的结果:按洗消机设定程序在工作槽内用臭氧水自动清洗6min和12min，该杆菌芽孢的平均杀灭率分别为99.87%和99.97%;在容器内用臭氧水流动浸泡30min，对枯草杆菌黑色变种芽孢的平均杀灭率为99.97%;对在试管中用该机生成的臭氧水浸泡40min，该杆菌芽孢的平均杀灭率仅为73.86%。说明在该机工作槽内用臭氧水自动清洗12min和在容器内用臭氧水流动浸泡30min，对枯草杆菌黑色变种芽孢的杀灭效果良好;在试管中用该机生成的臭氧水浸泡，对枯草杆菌黑色变种芽孢的杀灭效果欠佳，可能与试管中臭氧量有限而且随时间而衰减有关。文献报道，国内有一种臭氧消毒机，其臭氧发生量为1.62mg/min，对细菌繁殖体杀灭效果良好;臭氧水悬液定量杀菌作用差 ［3］ 。另一种多功能臭氧水消毒器的臭氧产生浓度为1.94mg/L，同样对细菌繁殖体杀灭效果良好，对枯草杆菌黑色变种芽孢悬液的杀灭率稍差 ［4］ 。说明上述相对低浓度的臭氧水对细菌繁殖体杀灭效果仍然良好，但对细菌芽孢杀灭效果不理想;相对低浓度的臭氧对水中的细菌直接作用时的杀灭效果好，但作为消毒水对菌悬液的杀菌效果较差。本试验的洗消机所产生的臭氧浓度，高于上述臭氧水消毒器产生浓度近6倍，且具有自动清洗的功能，洗消联合作用，有其一定的优越性。因此，不论用臭氧水自动清洗还是用臭氧水流动浸泡，对细菌芽孢的杀灭效果良好。
参考文献
1 沈伟.国内外内镜消毒动态.中国消毒学杂志，2002，19（3）:171-175.
2 赖晓全.内窥镜污染的现状及控制.中国消毒学杂志，2004，21（1）:60-62.
3 陈惠珍，林锦炎，黄美卿.一种臭氧消毒机的杀菌方法及杀菌效果研究.中国卫生检验杂志，2002，12（5）:538-539.
4 陆永梅，沈红，张雁.多功能臭氧水消毒器对微生物杀灭效果的试验观察.中国消毒学杂志，2004，21（1）:44-45.
（编辑建 伟）
作者单位:100021北京中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所