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【摘要】 目的 建立用HPLC-ELSD方法测定保儿宁颗粒中黄芪甲苷含量的方法。方法 采用ODS-C18;流动相为乙腈-水(35∶65),流速为1.0ml/min,ELSD参数:漂移管温度99.3℃,载气流速2.7L/min。结果 黄芪甲苷对照品进样量在0.392~2.352μg之间,进样量与峰面积二者对数值呈良好线性关系,加样回收率达100.3%,重现性试验RSD%值为2.7%。结论 HPLC-ELSD联用方法稳定可靠,可以用于黄芪甲苷定量。
【关键词】 HPLC-ELSD;保儿宁颗粒;黄芪甲苷;
含量测定保儿宁颗粒是由黄芪、白术等7味药材组成,其主要功能为益气固表,健中醒脾。黄芪为方中君药。其现代药理研究表明,黄芪具有增强免疫、抗疲劳、促进代谢等功用。而黄芪的活性成分主要为皂苷类,黄芪甲苷又是其主要活性成分之一[1]。据此,确定黄芪甲苷作为本制剂含量测定的指标。
1 试验方法学考察
1.1 含量测定计算方法 本药物采用高效液相色谱法,以蒸发光散射检测器来测定方中黄芪甲苷的含量。蒸发光检测器测得的峰面积积分值的对数与进样量的对数呈线性关系。所以对不同浓度的黄芪甲苷对照品的进样量和对应的峰面积积分值取对数后作直线方程。再把样品的峰面积积分值取对数后代入此直线方程,所得结果计算反对数。即可求得样品中黄芪甲苷的含量。
1.2 色谱条件的考察 (1)选择使用C18-ODS反相柱。填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶,做了柱长150mm与250mm的比较,确定了(4.6mm×250mm,5μm)的色谱柱分离效果较佳。(2)流动相的选择:①甲醇-水(75∶25)时,出峰时间6min。峰形分离不好;②乙腈-水(25∶75)时,峰形未分离完全;③乙腈-水(31∶69)时,同上;④乙腈-水(35∶65)时,分离度良好,峰形对称。出峰时间约在9min。所以,确定了该比例的乙腈-水(35∶65)的流动相,较为适宜。(3)检测器的选择:采用蒸发光散射检测器,即:ELSD2000。确定的色谱条件:C18-ODS(4.6mm×250mm,5μm)柱;流动相:乙腈-水(35∶65),流速1.0ml/min;蒸发光散射检测器(ELSD2000)参数:漂移管温度993℃,载气流速2.7L/min;Waters510高效液相色谱仪;黄芪甲苷(中国药品生物制品检定所)(供含量测定用);保儿宁颗粒,徐州颐海药业有限责任公司生产;空白对照颗粒,同上;乙腈为色谱纯,其他试剂为分析纯,水为重蒸水。
1.3 对照品溶液的配制 取在五氧化二磷干燥器中干燥的黄芪甲苷对照品适量,精密称定,加甲醇溶解得1ml含黄芪甲苷40μg的对照品溶液。
1.4 样品溶液制备方法的优选 采用单因素试验方法,分别考察溶媒用量、超声处理时长、及正丁醇萃取次数三种因素对提取效率的影响,确定了样品溶液制备方法:取本品约10.0g,精密称定,置碘量瓶中,加甲醇30ml超声处理30min,提取液浓缩蒸干,残渣加水15ml溶解,用水饱和的正丁醇20、20、15、15ml提取4次,合并正丁醇提取液,用氨试液洗涤两次,每次30ml,弃去氨液,正丁醇液蒸干,残渣加甲醇10ml溶解,经0.45μm微孔滤膜滤过,收集续滤液作为供试品溶液。
1.5 空白试验 按本制剂处方比例及制备工艺,不加入黄芪药材,制得缺黄芪的空白样品。按样品溶液制备方法制备空白对照溶液。分别精密吸取黄芪甲苷标准对照溶液、样品溶液和空白对照溶液各20μl,分别进样测定,可见:黄芪甲苷峰位在9min左右,样品溶液有同样的吸收峰,而空白溶液在相应位置无吸收,不影响黄芪甲苷定量。
1.6 标准曲线的制备 精密称定80℃减压干燥至恒重的黄芪甲苷对照品适量,加甲醇制成每1ml含0.392mg的溶液。分别精密吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml置10ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度。各精密吸取20μl,分别注入液相色谱仪,测定,测得峰面积。对峰面积与进样量进行双对数直线回归处理。即以进样量的对数与峰面积积分值的对数作线性关系。得回归方程y=1.460x+4.917;相关系数r=0.9998。表明黄芪甲苷进样量在 0.392~2.352μg之间与积分值呈双对数线性关系。
1.7 稳定性试验 按样品溶液制备方法制得供试溶液,精密吸取供试品溶液20μl注入液相色谱仪测定。分别于0、1、4、8、12、24h后测定1次。结果依次为112409、114458、113506、115905、112339、111206,RSD%为1.9%。表明供试溶液至少在24h内稳定。
1.8 精密度试验 精密称取黄芪甲苷对照品适量,加甲醇制成每1ml中含80μg的标准溶液。精密吸取20μl,连续进样5次。峰面积积分值依次为157319、156331、153754、154184、155108,RSD%达1.2%。表明仪器精密度良好。
1.9 回收率试验 采用加样回收试验方法,取已知黄芪甲苷含量的同批样品各6份,精密称定,分别精密加入黄芪甲苷对照品溶液(浓度0.23mg/ml)各1ml,按供试溶液制备方法,制备供试溶液,依法测定,计算回收率。结果见表1。RSD%=1.3% ,结果表明试验方法的回收率高,符合含量测定要求表1 回收率试验结果(略)
1.10 重现性试验 精密称取5份同一批次(批号20040901)样品,分别制备供试溶液,依法测定,样品含量值依次为:0.531、0.529、0.539、0.533、0.541mg/袋,RSD%为2.7%。试验方法重现性较好,适于定量。
2 样品含量测定
依上述建立的含量测定方法,对三批样品定量,结果见表2。表2 样品含量测定结果(略)
3 分析与总结
方法学考察结果表明:HPLC-ELSD联用测定黄芪甲苷含量重现性好,回收率高。方法准确可靠,可用于黄芪甲苷定量。通过三批保儿宁颗粒测定,黄芪甲苷含量均高于0.50mg/袋以上,据此确定本制剂含量标准。
《中国药典》2000年版收载用薄层扫描法测定黄芪甲苷含量。但我们经过多次实验研究(碱处理,过D101大孔树脂,中性氧化铝吸附等)结果均欠佳,拖尾严重,背景干扰大。所以,确定采用高效液相色谱法。
文献记载[2~4],利用HPLC-UV联用测定黄芪甲苷含量。经紫外扫描黄芪甲苷在203nm波长处有最大吸收。但处于末端,检测结果不明显,易受诸多因素影响。采用了蒸发光散射检测器检测后,则克服了上述不利的因素。具有专属性强、灵敏度高、不受杂质成分干扰等优点。所以,确定采用了高效液相色谱法-蒸发光散射检测器联用的方法,测定本方中黄芪甲苷的含量。
【参考文献】
1国家药典委员会.中华人民共和国药典.北京:化学工业出版社,2000,123.
2 席枝侠.反相高效液相色谱法测定黄芪蛰虫口服液中的黄芪甲苷含量.中国医药学杂志,2002,22(8):648-649.
3 陈定一.分析化学.北京:学苑出版社,1995,196.
4 肖崇厚,陆蕴如.中药化学.上海:上海科学技术出版社,1985,217.
作者单位: 221004 江苏徐州,徐州颐海药业有限责任公司
(编辑:苜 紫)