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【摘要】 目的 中药黄芩治疗豚鼠哮喘与C-JUN表达机制的关系。方法 卵蛋白致敏豚鼠复制哮喘模型。用C-JUN免疫组织化学技术观察，中药治疗哮喘前、后豚鼠呼吸部的原癌基因的表达与病理变化。结果 正常豚鼠的肺组织中原癌基因的表达没有或非常弱，模型组的原癌基因表达产物明显增强，治疗组可见少量的阳性细胞表达。结论 中药黄芩等对治疗过敏性哮喘具有明显的效果。
【关键词】 原癌基因；致敏；哮喘；表达产物
哮喘是临床的常见病、多发病，是由嗜酸粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞等多种类型细胞参与的气道的非特异性炎症［1］。主要是炎性细胞增多引起呼吸道的炎症反应，病理改变主要是支气管黏膜增厚、平滑肌痉挛、分泌物增多滞留所致引起可逆性阻塞，是引起气道重塑及气道高反应性的重要原因。原癌基因［2］是人体正常的基因，主要调控细胞的生长和分化，并参与许多疾病的发生、发展。C-JUN的表达是炎性细胞活化的早期指标，并与炎性细胞合成、分泌细胞因子和炎症介质有关，因此，通过检测C-JUN的表达来研究黄芩、甘草等治疗哮喘的机制，为临床治疗提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料 （1）动物采用豚鼠120只，雄性，体重300～400g，由辽宁中医学院实验动物中心提供。（2）黄芩50g，甘草30g，购于辽宁中医学院附属医院药局。氨茶碱片由赤峰制药厂出品。卵蛋白由上海化学试剂厂分装，GB275681，批号01113购于沈阳医药股份有限公司。
1.2 造模方法［3］ 将豚鼠120只随机分为4组：正常组、模型组、西药组（氨茶碱组）、中药组（黄芩、甘草汤组）。每组30只，正常组除外，其余的90只均用新鲜配制的10%卵蛋白溶液1ml腹腔注射1次，隔日1次，连续3次注射，14天后用新鲜配制的10%卵蛋白溶液进行雾化激发，直到出现鼻翼扇动、腹肌抽动、喷嚏、咳嗽等症状，每天1次，激发前正常组和模型组给予生理盐水灌胃，西药氨茶碱用注射用水稀释成10%浓度的溶液，中药每次用1∶10水煎，连续煎3次，每次100mg，将300mg浓缩为100mg，每次根据人、动物体表面积比计算而成。氨茶碱组豚鼠灌胃药量为0.05g/kg，中药组豚鼠灌胃量为0.4g/kg，每日1次，连续7天，分别于最后1次激发后6h、12h、24h取材。
1.3 样品制备 用10%水合氯醛350mg/kg，腹腔注射麻醉，取仰卧位固定，剖开胸腔，暴露心脏，生理盐水100ml冲洗，4%PBS配制4℃配制的多聚甲醛250ml缓慢灌流，固定30min，双同侧部位的肺子标本置于同一固定液中固定12h，随之浸泡于20%蔗糖液内在4℃下进行，使组织沉入水中，取出蒸馏水冲洗后，于-20℃恒冷箱切片机切片，厚度为15μm厚的跳片捞出，置于预先制备好的多聚赖氨酸处理过的载玻片上，待冷风吹干，冰箱冷藏备用。
C-JUN蛋白免疫组织化学染色：按SABC法进行，将15μm厚切片入含0.3%H2O2的甲醛溶液（80%甲醛配制）30min，加入含0.1%TritunX100的绵羊抗C-JUN血清（7∶400，0.01mol/L PBS，pH7.2～7.4配制）37℃孵育30min，4℃孵育48h，加入生物免抗绵羊18G(1∶300，0.01mol/L PBS配制)4℃孵育24h，置入抗链球菌蛋白生物素标记。
2 结果
2.1 C-JUN的观察（动物实验结果） C-JUN的蛋白表达呈棕褐黄色颗粒，背景无色或乳白色，反差良好。正常组：豚鼠呼吸道上皮及肺组织的C-JUN着色极浅，背景无色，空白对照组与替代对照组的实验观察均呈阴性。模型组6h、12h、24h C-JUN蛋白颗粒主要表达逐步增强，分布于支气管及细支气管的上皮细胞中，成纤维细胞及炎性细胞也可见到少量的阳性表达，空白对照组与替代对照组均呈阴性。治疗组6h、12h、24h C-JUN的蛋白表达逐渐减弱，24h以后接近于正常组。个体差异也有少量的颗粒表达，主要是终末性支气管，肺泡管等可见浅色的阳性颗粒。以上均做苏木精复染细胞核，镜下观察，结构完整，细胞轮廓清晰可辨。
2.2 病理组织学观察 哮喘组豚鼠激发后，6h、12h、24h光镜下观察，肺组织中间的细支气管和终末性支气管，管腔及肺泡内可见有少量的嗜酸粒细胞、中性粒细胞浸润，白细胞浸润加重，嗜酸粒细胞、中性粒细胞明显增多，24h炎性细胞加重，但是以嗜酸粒细胞为主。治疗组、中药组与西药组组间差异不明显，6h、12h光镜下观察肺组织中的炎性细胞逐步减轻，24h后炎性细胞明显好转。
3 讨论
气道慢性炎症是哮喘的基本病理改变，其中活化的炎症细胞浸润是引起气道平滑肌增厚，气道高反应性的病理基础，而C-JUN的蛋白表达是炎症细胞活化的早期标志，故本实验旨在应用豚鼠哮喘模型，观察致敏原激发后不同时间点气道壁中的C-JUN蛋白表达的情况，为临床治疗哮喘提供了科学依据。
大量的资料证明，受外来的激发因子的作用，浸润的炎症细胞，通过免疫和非免疫的途径释放各种细胞因子，而细胞因子又能促使炎症细胞在气道黏膜下进一步聚集，使气道分泌物增多、气管平滑肌痉挛性收缩、上皮细胞脱落等，近年来研究认为原癌基因几乎参与信号传递通路和每一个环节［4］，该类基因对神经递质、激素、炎性介质等外界刺激引起的传入信息，在数分钟内作出反应，进行表达对生命活动的重要作用，C-JUN为即刻早期原癌基因之一，外源刺激数分钟即可开始转录其mRNA，为细胞增殖及生物合成的早期标志。
中药由黄芩和甘草组成，黄芩中含有一种苷的有效成分，能抑制肥大细胞脱颗粒，组胺的释放，如荨麻疹、支气管哮喘等，抑制过敏反应的发生。甘草中的甘草甜素可增强机体的非特异性免疫功能，甘草黄酮、甘草浸膏及甘草次酸均有止咳化痰作用，而且腹腔注射甘草水煎剂等，也具有一定的止咳作用，甘草及其成分具有抗炎作用，所以从药理作用上看，黄芩甘草汤可以化痰平喘，具有治疗过敏性哮喘的作用。
而且，本实验结果证明，中药组和模型组的病理切片观察差异具有显著性，中药组与西药组比较差异无显著性，这也从客观指标上说明，中药的治疗作用在临床是可以广泛应用的。
【参考文献】
1 戚好文，李焕章.原癌基因表达与哮喘气道炎症细胞浸润的关系.中国病理生理杂志，2001，17（4）：293.
2 徐晓利，马涧泉.医学生物化学.北京：人民卫生出版社，1998，444.
3 吕国平，崔德建，郭英江，等.介绍一种建立大鼠哮喘模型的实验方法.中华结核和呼吸杂志，1995，18（6）：377.
4 卢圣栋.现代分子生物实验技术.北京：中国协和医科大学出版社，2001，220.
(编辑：乔 晓)
作者单位： 110032 辽宁沈阳，辽宁中医学院显微形态实验室
110032 辽宁沈阳，辽宁中医学院信息工程学院