疏血通对脑缺血再灌注损伤的保护作用及其对抗氧化指标的影响

    【摘要】  目的  探讨疏血通对沙土鼠缺血再灌注脑组织的保护作用及其机制。方法  48只成年雄性沙土鼠随机分成假手术组、缺血再灌注组和治疗组，阻断双侧颈总动脉7min后使血液复流，制成沙土鼠脑缺血再灌注模型。每组随机取8只沙鼠于再灌注后24h处死，分离出海马区及额顶部脑组织，作脑组织匀浆。测定脑组织匀浆中的SOD、MDA的含量，同时对再灌注后12h、3天、7天海马区组织的病理学改变进行观察。然后比较假手术组、缺血再灌注组和治疗组上述指标的变化与不同。结果  缺血再灌注后12h治疗组较缺血再灌注组海马CA1区神经元变性、坏死程度明显减轻，随再灌注时间的推移两组变性、坏死及形态不规则的神经元均逐渐增多；超微结构显示治疗组细胞器、细胞核及细胞内膜系统的损伤性改变较缺血再灌注组明显减轻。治疗组SOD的含量明显高于缺血再灌注组（P<0.05），而缺血再灌注组SOD含量明显低于假手术组（P<0.05）；治疗组MDA的含量则明显低于缺血再灌注组（P<0.05），而缺血再灌注组MDA的含量明显高于假手术组（P<0.05）。结论  疏血通可以提高缺血再灌注脑组织内SOD的含量、对抗自由基、抑制脂质过氧化反应，从而对缺血再灌注脑组织的损伤发挥保护作用。

    【关键词】  疏血通；再灌注损伤；抗氧化系统

      The protective effect of Shuxuetong on cerebral ischemiareperfusion injury and influence to antioxidative indexes

    ZHANG Dongjun，LI Zhiyuan，DING Li-gong，et al.Department of Neurology，Qilu Hospital of Shandong University，Jinan 250012，China

    【Abstract】  Objective  To study the protective effect and mechanism of Shuxuetong on gerbil brain tissue in the area of ischemiareperfusion.Methods  48 male gerbils were divided into three groups:sham operation group，ischemiareperfusion group and treatment group.Cerebral ischemiareperfusion in gerbils was made by transient clipping bilateral common carotid arteries for 7 minute.8 gerbils were selected at random and put to death at 24 hours after reperfusion in each group.Hippocampal and frontalparietal tissue were separated for making homogenate.Contents of SOD and MDA of brain tissue were measured at 24 hours after reperfusion.Pathological changes in the hippocampal tissue were observed at different reperfusion time （12th hours，3th days，7th days after reperfusion）.The difference of above indices among sham operation group，ischemiareperfusion group and treatment group were compared.Results  Degeneration and necrosis of hippocampal neuron significantly relived at 12 hours after reperfusion in treatment group compared with ischemiareperfusion group.The injuries of organell，cell nucleus membrane system more relieved in treatment group than in ischemiareperfusion group.The contents of SOD in treatment group were significantly increased compared with ischemiareperfusion group （P<0.05） and the contents of SOD in ischemiareperfusion group significantly decreased compared with sham operation group （P<0.05），but the contents of MDA had converse changes between treatment group and ischemiareperfusion group.Conclusion  Shuxuetong has protective effect on brain tissue of ischemiareperfusion by increasing the activities of SOD，resisting free radical，restraining peroxidization of lipid.

    【Key words】  Shuxuetong;ischemiareperfusion injury;antioxidative system

    近年来，随着临床上对缺血性脑血管病溶栓疗法的逐渐开展，再灌注损伤的问题越来越受到重视。许多研究表明，脑缺血再灌注损伤与自由基的产生、兴奋性氨基酸（exacitatory amino acids，EAA）的过量释放、炎症反应等密切相关［1~3］。因此，探讨药物对缺血再灌注损伤的作用也成为广大学者普遍关注的问题。我国拥有丰富的中医药资源，探讨中药对缺血再灌注损伤的保护作用不容忽视。疏血通是根据传统中医药理论，以水蛭、地龙为主组方，经现代科学工艺提取有生物活性成分而制成。根据现代药理研究，水蛭、地龙的有效成分主要在改善血液循环方面起作用，但其有效成分在脑缺血再灌注后能否影响与缺血再灌注损伤的有关因素，进而发挥保护作用的研究尚未见报道。本课题利用沙土鼠脑缺血再灌注模型，从超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）以及组织病理学方面来探讨疏血通对脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制，为临床上应用疏血通治疗急性脑梗死提供试验依据。

    1  材料与方法

    1.1  动物分组及模型制备

    1.1.1  分组  成年蒙古沙土鼠48只（由山东省泰山医学院生理教研室动物饲养中心提供），雄性，体重50~70g，随机分为3组，每组16只，即：（1）假手术组：仅通过手术分离出双侧颈总动脉而不夹闭；（2）缺血再灌注组：同时夹闭双侧颈总动脉7min后再灌注；（3）治疗组：采用疏血通注射液（由山西远扬药业公司提供）灌胃给药，按0.6ml/kg体重的剂量灌胃给药，每日1次，连续3天，末次给药在缺血前30min。

    1.1.2  模型制备  采取乙醚吸入麻醉，颈前部正中切口，分离颈总动脉，用银制动脉夹同时夹闭双侧颈总动脉7min，然后松开双侧动脉夹使血液复流，丝线缝合切口，即造成沙土鼠前脑缺血再灌注模型，术后保温常规饲养。

    1.2  脑组织标本采集及匀浆的制备  每组随机抽取8只沙土鼠于缺血再灌注后24h处死取材作脑组织匀浆。处死后，迅速断头取脑，在冰盘中分离出海马区及额顶部脑组织，以脑组织（mg）：生理盐水（ml）=10∶1的比例，在盛有冰块的器皿中用玻璃匀浆器研磨成脑匀浆。4℃，3000r/min离心20min，取上清液于-30℃以下低温保存待测。

    1.3  病理组织切片的制作及病理结构观察

    1.3.1  光学显微镜切片的制作与观察  每组随机取6只沙土鼠分别于缺血再灌注后12h、第3天和第7天（每个时间点随机取2只沙土鼠）取海马部及额顶部脑组织。以4%的多聚甲醛自左心室灌注固定脑组织，断头，轻轻剥离颅骨取脑，置于4%多聚甲醛中固定保存。然后将鼠脑沿视交叉中部将前脑切除，后部将小脑及脑干切除。然后将修好的脑组织块依次进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，切片厚度为5μm。以1%焦油紫+0.05%嗜天青Ⅱ+0.25%甲苯胺蓝进行神经细胞尼氏小体染色，以中性树脂封固后，置37℃温箱中烤干，光镜下观察海马CA1区神经细胞的形态变化。

    1.3.2  电子显微镜切片的制作与超微结构观察  每组于缺血再灌注后12h后取2只沙土鼠，处死后立即在冰盘内剥离海马，然后切成1mm3大小的组织块，4%多聚甲醛固定24h后，2%锇酸固定，脱水，浸透，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铀及枸橼酸铅双重染色，运用日本产JEM-1200EX透射电镜观察。

    1.4  脑组织匀浆SOD、MDA的测定  采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD的含量，脑组织匀浆的取样量为50μl，检测按试剂盒说明书操作；采用硫代巴比妥酸法（TBA）测定MDA的含量，脑组织匀浆的取样量为0.2ml，检测按试剂盒说明书操作。试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

    1.5  统计学方法  结果中计量资料均采用均数±标准差（x±s）表示，运用SPSS 10.0统计软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，再用LSD法进行两两比较。

    2  结果

    2.1  组织学改变  缺血再灌注组于再灌注后12h可见海马CA1区神经元有不同程度的变性、坏死，大部分细胞形态不规则，胞体和间质明显水肿，形态正常的神经元减少；3天后大量细胞变性、坏死，形态极不规则，形态正常的神经元明显减少，而细胞和间质水肿消失；7天后大量坏死的细胞已崩解消失，仍有部分形态不规则的神经元细胞残留，形态正常的神经元所剩无几或不能看到。治疗组于再灌注后12h可见CA1区部分神经元形态不规则，仅少数神经元出现变性、坏死，胞体和间质水肿不明显；3天后变性、坏死及形态不规则的神经元逐渐增多，形态正常的神经元减少；7天后大部分神经元坏死、消失，仍可见少数形态不规则的神经元细胞及部分形态正常的神经元。

    2.2  超微结构观察  缺血再灌注组可见细胞核变形呈不规则状，染色质明显边集或聚集成团块状，细胞质中可见高密度致密小体（见图1）。部分核膜、线粒体膜崩解，线粒体嵴消失，部分线粒体呈空泡变性，损伤累及许多膜系统并使其崩溃，多数细胞器分辨不清（见图2）。治疗组核膜完整，染色质边集和聚集均轻微，线粒体膜和内质网膜均完整，线粒体规则，粗面内质网的核糖小体脱失轻微且清晰可见（见图3）。图4为假手术组。

    2.3  各组脑组织匀浆中SOD、MDA含量变化  SOD、MDA含量在各组间差异均有统计学意义（F=72.89、158.81、44.36、139.12，P<0.05）。治疗组SOD含量明显高于缺血再灌注组（P<0.05），而缺血再灌注组SOD含量明显低于假手术组（P<0.05）；治疗组MDA含量明显低于缺血再灌注组（P<0.05），而缺血再灌注组MDA含量明显高于假手术组（P<0.05）。见表1。 表1  各组脑组织SOD、MDA含量变化 注：*P<0.05 compared with ischemiareperfusion group;#P<0.05 compared with false operation group

    3  讨论

    疏血通注射液是以水蛭、地龙为主组方，经现代科学工艺加工提取有生物活性的成分制成的注射液，含有水蛭素样作用和蚓激酶样作用的物质，主要是氨基酸、小分子肽、黏多糖等。根据现代药理研究结果，两药具有扩血管、改善微循环、抗凝、抗血小板聚集等作用。

    3.1  疏血通对缺血再灌注脑组织的保护作用  我们通过焦油紫对神经细胞的尼氏小体染色，对缺血再灌注后海马CA1区病理改变以及疏血通治疗后的病理变化进行了动态观察，结果发现在缺血7min再灌注12h后即有明显的细胞变性坏死，3天后细胞损伤进一步加重，至第7天海马CA1区的细胞成分所剩无几，难以见到正常的细胞。说明缺血再灌注对海马CA1区的损害非常严重，这与其他学者的研究相似［4］。对缺血再灌注12h后的超微结构观察，发现细胞内的各种细胞器包括线粒体损伤严重，染色质大量边集，膜系统大量崩解。而应用疏血通治疗后，通过尼氏小体染色亦显示随着再灌注后时间的推移损伤进行性加重，但损伤较缺血再灌注组明显减轻；超微结构则显示了疏血通对细胞内部结构具有良好的保护作用，尤其是对膜系统的保护最为有效。总之，无论是尼氏小体染色光镜下的变化还是超微结构的改变，均提示应用疏血通治疗组于缺血再灌注12h后海马CA1区神经元的病理损伤性改变较缺血再灌注组减轻，这足以肯定疏血通对脑缺血再灌注损伤的保护作用。随再灌注后时间的推移在光镜下发现疏血通治疗组海马CA1区神经元亦有进一步损伤的现象，考虑可能与缺血再灌注后未继续用药使体内有效药物浓度下降有关，即药物浓度下降后，不能进一步抵御缺血再灌注后的迟发性神经元损伤，这有待进一步研究证实。

    3.2  脑缺血再灌注后SOD、MDA的变化及疏血通的作用  自由基对机体的损伤是由于分子中含有不配对的电子，其性质活泼，易与脂类、蛋白质和核酸发生反应，引起一系列过氧化损伤。脑缺血缺氧时，线粒体内膜电子传递链的氧化还原状态失衡以及脑缺血再灌注病理过程是产生大量的自由基［5，6］，自由基作用于脂质生物膜，使生物膜上的不饱和脂肪酸发生质脂过氧化反应，进一步影响膜结构和功能。中枢神经系统内含有大量的不饱和脂肪酸，易发生质脂过氧化反应，生成大量的脂质过氧化产物，因而测定脂质过氧化产物的稳定代谢物MDA的含量可反映组织自由基的含量和脂质过氧化程度。

    SOD是一种带阴性电荷的金属蛋白酶，在体内有Cu-Zn SOD、Mn SOD和Fe SOD 3种形式，是体内非常重要的氧自由基清除剂。它通过歧化方式（氧化的同时还原）清除超氧阴离子自由基O-   ·2。在脑缺血及其再灌注时导致血-脑屏障开放，可使SOD进入到内皮细胞的胞浆和脑组织细胞外间隙，发挥清除O-   ·2的作用［7］。

    SOD是细胞内主要的对抗氧自由基的酶促抗氧化防御系统，SOD能使氧自由基在生理pH环境转化成O2和H2O，脂质过氧化反应产物的增加可由自由基产生过多或其清除系统功能的丧失引起。本实验研究发现，应用疏血通治疗组于缺血再灌注24h后脑组织匀浆中SOD水平较缺血再灌注组明显增高，而MDA水平较缺血再灌注组明显降低，治疗组及缺血再灌注组与假手术组相比较，SOD均低于假手术组，而MDA均高于假手术组，这表明疏血通能够提高缺血再灌注后脑组织内SOD的含量，从而抑制质脂过氧化反应，减少MDA的生成。因此疏血通具有一定的抗自由基作用，其对脑缺血再灌注损伤的保护作用可能与抑制自由基产生、减少抗氧化剂的消耗有关。

    总之，疏血通可以提高缺血再灌注脑组织内SOD的含量，对抗自由基，抑制脂质过氧化反应，并通过此途径对缺血再灌注脑组织的损伤发挥保护作用。

    （本文图片见封三）

    【参考文献】

    1  Dykens JA，Eriksan JM，Velasco CE，et al.Mechanisms of kainite toxity to cerebellar neurons in vitro is analogous to reperfusion tissue injury.J Neurochem，1987，49:1222.

    2  Bullock R，Zauner A，Woodwand J，et al.Massive persistent release of excitatory amino acids following human occlusive.Stroke，1995，26:2187.

    3  陈兴州，陆兵勋.局灶性脑缺血后再灌注损伤的炎症机制与治疗前景.国外医学·脑血管疾病分册，1999，7：136.

    4  郑健，董为伟，赵士福.大鼠脑缺血再灌流后海马氨基酸水平变化与神经元损害的关系探讨.中风与神经疾病杂志，1999，16：73.

    5  Abe K，Kogure K，Yamamoto H，et al.Mechanism of arachidonic acid liberation during ischemia in gerbil cortex.J Neurochem，1987，48:503.

    6  Fisher SK，Agranoff BW.Receptor activation and inositol lipid hydrolysis in neural tissues.J Neurochem，1987，48:999.

    7  夏绪刚，黄兆民，欧阳珊.氯喹、SOD防止脑缺血再灌注损伤的实验研究.中风与神经疾病杂志，1997，14：84.

     作者单位： 1 250012 山东济南，山东大学齐鲁医院脑血管病科

    2 山东菏泽，菏泽市立医院

    3 山东胶南，胶南市中医院

    4 山东济南，济南长城医院

    5 山东泰安，泰山医学院生理教研室

   （编辑：于  伽）