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【摘要】 目的 通过研究电针内关对心肌缺血再灌注损伤过程中大鼠、NO及线粒体超微结构的影响,阐明电针内关对心肌缺血再灌注损伤的作用机制。方法 在大鼠冠状动脉左前降支根部穿线建立心肌缺血再灌注损伤模型,电针内关穴,检测心肌组织NO含量,透射电镜下观察心肌组织线粒体的超微结构变化。结果 内关穴组心肌组织NO含量高于模型组(P<0.01);模型组线粒体水肿、空泡变,线粒体膜破裂、嵴消失。电针内关组线粒体嵴排列整齐,仅见部分线粒体轻度水肿。结论 电针内关穴可使心肌NO含量升高,明显减轻线粒体超微结构的变化,从而在一定程度上对心肌缺血再灌注损伤心肌起到保护作用。
【关键词】 心肌再灌注损伤;NO;线粒体;电针
大量实验和临床研究均证实针刺心包经内关穴对缺血心肌具有明显的保护作用。而降低缺血再灌注损伤的程度,有效保护心肌也一直是国内外医学界十分关注的课题。本项研究通过观察电针内关对心肌缺血再灌注损伤大鼠NO及线粒体超微结构变化的影响,阐明电针内关抑制心肌缺血再灌注损伤的作用机制。NO不仅可调控冠脉血管舒缩,维持有效的循环血流,而且对缺血后心肌的转归及心肌功能的恢复亦有重要的作用,当心肌发生缺血再灌注时,明确缺血心肌处NO的变化规律及NO对心肌功能的影响有着重要的意义[1]。线粒体是细胞内生物氧化的主要场所,当心肌缺血再灌注损伤发生时,线粒体的结构发生显著的变化,严重时会出现不可逆性损伤[2]。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
Wistar大鼠50只,体重250~300g,雄性,由湖南中医学院动物中心提供。将50只动物随机分为5组:假手术组、缺血再灌注模型组、针刺内关治疗组、针刺列缺对照组、针刺合谷对照组,每组10只动物。
1.2 实验过程
10%乌拉坦(1ml/kg)腹腔麻醉,气管插管,接动物人工呼吸机,于T3~T4间隙处开胸,暴露心脏,冠状动脉左前降支根部穿0号医用缝合线,心电图监测,穿线处置一硅胶管结扎左前降支,以左室前壁发绀并向外膨胀及心电图S-T段抬高为标志。关闭胸腔,40min后开胸,剪开硅胶管,恢复左前降支灌流,60min后,摘取心脏。
假手术组:冠状动脉左前降支根部穿线后,心电图监测,记录100min内心电图S-T段变化,取静脉血,摘取心脏。缺血再灌注模型组:左冠状动脉前降支根部穿线后,心电图监测,结扎左前降支40min,再灌注60min后,摘取心脏。电针内关治疗组、电针列缺对照组、电针合谷对照组:冠状动脉左前降支根部穿线后,心电图监测,关闭心电图机。电针穴位20min,去电针。心电图监测,结扎左前降支40min,电针穴位20min,再灌注60min后,摘取心脏。
1.3 针刺方法
“内关”和“合谷”穴定位参照《中国针灸荟萃·兽医针灸卷》标准穴位图谱定位;“列缺”定位采取拟人比照法。电针用G6805电针仪,疏密波刺激(疏波30Hz,密波100Hz),强度6~15V,进针深度0.5cm左右,以前肢出现轻微颤动为准。
1.4 观察指标与检测方法
心肌组织NO检测:摘取心脏,置于冰冷的生理盐水中冲洗,除去血液,滤纸拭干,分析天平称取0.2g心肌组织,放入小烧杯内,用刻度吸管加入组织块重量的9倍生理盐水,眼科小剪尽快剪碎组织块。剪碎组织倒入玻璃匀浆管中,置于匀浆机上,制成10%的组织匀浆液,3500r/min离心15min,吸取0.5ml上清液,用754紫外分光光度计测定550nm波长下的吸光度值(A),计算NO含量。以双缩脲法测定其组织匀浆液蛋白含量[NO含量单位为μmol/(g·pr)]。试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。
心肌组织线粒体超微结构观察:取缺血心肌组织5mm×3mm×2mm大小,2.5%戊二醛固定24h以上,OSO4后固定,丙酮梯度脱水,环氧树脂浸泡、包埋,修块后用瑞典产LKB-Ⅲ型超薄切片机切片,厚约500~700A°,铅铀双重染色,H-600透射电镜观察、拍片。
1.5 统计学方法
各组数据均以均数±标准差(x±s)表示,单因素方差分析进行组间比较。
2 结果
2.1 心肌组织NO含量
电针内关组与模型组相比,NO含量明显升高,差异有显著性(P<0.05);列缺组、合谷组心肌NO含量虽有升高,但与模型组相比较差异无显著性(P>0.05),见表1。提示电针内关可使心肌再灌注损伤过程中局部NO含量增高。
表1 各组大鼠心肌组织NO含量比较(略)
注:与模型组比较:*P<0.05;与列缺组比较:△P<0.05;与合谷组比较:#P<0.05
2.2 心肌组织线粒体超微结构
假手术组肌纤维排列整齐,线粒体丰富,未见水肿及空泡变;模型组肌细胞胞浆水肿,线粒体水肿、空泡变,线粒体膜破裂,嵴消失;线粒体嵴致密变性;内关组大多数线粒体正常,嵴排列整齐,仅见部分轻度水肿;列缺组线粒体水肿、变性,空泡变,与模型组无差异;合谷组线粒体嵴紊乱,中度水肿。
3 讨论
NO是一种生物活性分子,主要由血管内皮细胞(VEC)合成,通过增加细胞内的cGMP而发挥广泛的生物作用[3]。NO不仅参与了对冠脉血管舒缩的调控,维持有效的冠脉循环血流,而且对缺血后心肌的转归及心肌功能的恢复,减轻炎症介导的心肌细胞坏死等方面可能起重要的作用[4]。当心肌发生缺血再灌注损伤时(MIRI),其缺血心肌处NO的变化规律及NO对心肌功能的影响有着重要意义。Johnson等最早提出NO可减轻心肌缺血再灌注损伤,猫在局部缺血90min后再灌注,于缺血30min起给予酸化亚硝酸钠或NO饱和的等渗氯化钠溶液持续灌注,可明显缩小心肌坏死面积[5]。我们以往的实验也证实电针内关穴可明显降低缺血—再灌注损伤的程度,对心肌细胞有着良好的预防保护作用[6,7]。本实验通过在缺血前与缺血再灌注同时电针手厥阴心包经内关穴,使心肌组织中NO、NOS与同工酶中cNOS的活性增强,从而减轻了心肌缺血再灌注损伤的程度,对心肌细胞有良好的保护作用。
线粒体的超微结构在1952年有了详尽的描述,它是人体最基本最重要的细胞器之一,由内膜、外膜、嵴(嵴突)、外周间隙、嵴间隙、基质等组成了一个封闭的膜系统。线粒体具有极其复杂的结构和生化功能,因此其超微病变也是多方面的,由于代谢上的变化,可引起形态上的异常,而线粒体也是对各种毒性反应特别敏感的细胞器,生理病理的反应是十分复杂的。表现在代谢的变化和缺血性损伤的反应两个方面[8]。实验研究证明离体心脏在体外有氧灌注条件下,结扎冠状动脉,在超过一定生理时限后(约20~30min)再开放灌注,则出现心肌细胞内线粒体高度肿胀、水肿、嵴分离、断裂或形成大小不等的空泡。心肌梗死患者尸检早期取材的标本在电镜下观察到,心肌细胞内线粒体广泛肿胀、水肿、嵴分裂,并形成大小不等的空泡[9]。我们的研究结果显示假手术组肌纤维排列整齐,线粒体丰富,未见水肿及空泡变;模型组变化明显,线粒体水肿、空泡变、线粒体膜破裂,嵴消失,线粒体嵴致密变性;电针内关组大多数线粒体正常,嵴排列整齐,仅见部分轻度水肿;电针列缺组和电针合谷组线粒体均出现水肿、变性,空泡变,嵴紊乱。说明电针厥阴经内关穴明显改善了心肌细胞线粒体的损伤状态,这种作用在电针肺经的列缺穴及大肠经的合谷穴时不太明显,从而也证实了电针对心肌细胞的保护作用是与经脉(穴)脏腑间的特异联系分不开的。
【参考文献】
1 丁钢,黄永麟.心肌缺血再灌注时一氧化氮与心功能的关系.心血管学进展,1999,20(5):287-289.
2 Silver MD.Cardiovascular pathology.New York:Churchill Livigstone,1983,50-51.
3 Dinerman JL,Lowenstein CJ,Snyder SH.Molecular mechanisms of nitric oxide regulation.Potential relevance to cardiovascular disease.Circ Res,1993,73(2):217-222.
4 刘林.一氧化氮在心血管系统疾病中的作用和地位.第二军医大学学报,2002,23(1):90-92.
5 Johnson G,Tsao PS,Mulloy D,et al.Cardioprotective effects of acidified sodium nitrite in myocardial ischemia with reperfusion.J Pharmacol Exp Ther,1990,252(1):35-41.
6 严洁,田岳凤,林亚平,等.电针内关对心肌缺血再灌注损伤肌酸激酶及丙二醛的影响.湖南中医学院学报,2000,20(3):62-63.
7 田岳凤,林亚平,严洁,等.电针内关对心肌缺血-再灌注损伤预防保护作用的实验研究(Ⅰ)——对CK、ET、MDA、NO、NOS等的影响.中国中西医结合急救杂志,2002,9(1):12-14.
8 洪涛.生物医学超微结构与电子显微镜技术.北京:人民卫生出版社,1980,337-345.
9 谷伯起.心血管病理学.北京:人民卫生出版社,1992,62-68.
基金项目:湖南省自然基金资助项目(NO.OOJJYI006S)
作者单位: 410007 湖南长沙,湖南中医药大学针推系
(编辑:周 蕊)
【摘要】 目的 通过研究电针内关对心肌缺血再灌注损伤过程中大鼠、NO及线粒体超微结构的影响,阐明电针内关对心肌缺血再灌注损伤的作用机制。方法 在大鼠冠状动脉左前降支根部穿线建立心肌缺血再灌注损伤模型,电针内关穴,检测心肌组织NO含量,透射电镜下观察心肌组织线粒体的超微结构变化。结果 内关穴组心肌组织NO含量高于模型组(P<0.01);模型组线粒体水肿、空泡变,线粒体膜破裂、嵴消失。电针内关组线粒体嵴排列整齐,仅见部分线粒体轻度水肿。结论 电针内关穴可使心肌NO含量升高,明显减轻线粒体超微结构的变化,从而在一定程度上对心肌缺血再灌注损伤心肌起到保护作用。
【关键词】 心肌再灌注损伤;NO;线粒体;电针
【中图分类号】 R365
大量实验和临床研究均证实针刺心包经内关穴对缺血心肌具有明显的保护作用。而降低缺血再灌注损伤的程度,有效保护心肌也一直是国内外医学界十分关注的课题。本项研究通过观察电针内关对心肌缺血再灌注损伤大鼠NO及线粒体超微结构变化的影响,阐明电针内关抑制心肌缺血再灌注损伤的作用机制。NO不仅可调控冠脉血管舒缩,维持有效的循环血流,而且对缺血后心肌的转归及心肌功能的恢复亦有重要的作用,当心肌发生缺血再灌注时,明确缺血心肌处NO的变化规律及NO对心肌功能的影响有着重要的意义[1]。线粒体是细胞内生物氧化的主要场所,当心肌缺血再灌注损伤发生时,线粒体的结构发生显著的变化,严重时会出现不可逆性损伤[2]。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
Wistar大鼠50只,体重250~300g,雄性,由湖南中医学院动物中心提供。将50只动物随机分为5组:假手术组、缺血再灌注模型组、针刺内关治疗组、针刺列缺对照组、针刺合谷对照组,每组10只动物。
1.2 实验过程
10%乌拉坦(1ml/kg)腹腔麻醉,气管插管,接动物人工呼吸机,于T3~T4间隙处开胸,暴露心脏,冠状动脉左前降支根部穿0号医用缝合线,心电图监测,穿线处置一硅胶管结扎左前降支,以左室前壁发绀并向外膨胀及心电图S-T段抬高为标志。关闭胸腔,40min后开胸,剪开硅胶管,恢复左前降支灌流,60min后,摘取心脏。
假手术组:冠状动脉左前降支根部穿线后,心电图监测,记录100min内心电图S-T段变化,取静脉血,摘取心脏。缺血再灌注模型组:左冠状动脉前降支根部穿线后,心电图监测,结扎左前降支40min,再灌注60min后,摘取心脏。电针内关治疗组、电针列缺对照组、电针合谷对照组:冠状动脉左前降支根部穿线后,心电图监测,关闭心电图机。电针穴位20min,去电针。心电图监测,结扎左前降支40min,电针穴位20min,再灌注60min后,摘取心脏。
1.3 针刺方法
“内关”和“合谷”穴定位参照《中国针灸荟萃·兽医针灸卷》标准穴位图谱定位;“列缺”定位采取拟人比照法。电针用G6805电针仪,疏密波刺激(疏波30Hz,密波100Hz),强度6~15V,进针深度0.5cm左右,以前肢出现轻微颤动为准。
1.4 观察指标与检测方法
心肌组织NO检测:摘取心脏,置于冰冷的生理盐水中冲洗,除去血液,滤纸拭干,分析天平称取0.2g心肌组织,放入小烧杯内,用刻度吸管加入组织块重量的9倍生理盐水,眼科小剪尽快剪碎组织块。剪碎组织倒入玻璃匀浆管中,置于匀浆机上,制成10%的组织匀浆液,3500r/min离心15min,吸取0.5ml上清液,用754紫外分光光度计测定550nm波长下的吸光度值(A),计算NO含量。以双缩脲法测定其组织匀浆液蛋白含量[NO含量单位为μmol/(g·pr)]。试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。
心肌组织线粒体超微结构观察:取缺血心肌组织5mm×3mm×2mm大小,2.5%戊二醛固定24h以上,OSO4后固定,丙酮梯度脱水,环氧树脂浸泡、包埋,修块后用瑞典产LKB-Ⅲ型超薄切片机切片,厚约500~700A°,铅铀双重染色,H-600透射电镜观察、拍片。
1.5 统计学方法
各组数据均以均数±标准差(x±s)表示,单因素方差分析进行组间比较。
2 结果
2.1 心肌组织NO含量
电针内关组与模型组相比,NO含量明显升高,差异有显著性(P<0.05);列缺组、合谷组心肌NO含量虽有升高,但与模型组相比较差异无显著性(P>0.05),见表1。提示电针内关可使心肌再灌注损伤过程中局部NO含量增高。
表1 各组大鼠心肌组织NO含量比较(略)
注:与模型组比较:*P<0.05;与列缺组比较:△P<0.05;与合谷组比较:#P<0.05
2.2 心肌组织线粒体超微结构
假手术组肌纤维排列整齐,线粒体丰富,未见水肿及空泡变;模型组肌细胞胞浆水肿,线粒体水肿、空泡变,线粒体膜破裂,嵴消失;线粒体嵴致密变性;内关组大多数线粒体正常,嵴排列整齐,仅见部分轻度水肿;列缺组线粒体水肿、变性,空泡变,与模型组无差异;合谷组线粒体嵴紊乱,中度水肿。
3 讨论
NO是一种生物活性分子,主要由血管内皮细胞(VEC)合成,通过增加细胞内的cGMP而发挥广泛的生物作用[3]。NO不仅参与了对冠脉血管舒缩的调控,维持有效的冠脉循环血流,而且对缺血后心肌的转归及心肌功能的恢复,减轻炎症介导的心肌细胞坏死等方面可能起重要的作用[4]。当心肌发生缺血再灌注损伤时(MIRI),其缺血心肌处NO的变化规律及NO对心肌功能的影响有着重要意义。Johnson等最早提出NO可减轻心肌缺血再灌注损伤,猫在局部缺血90min后再灌注,于缺血30min起给予酸化亚硝酸钠或NO饱和的等渗氯化钠溶液持续灌注,可明显缩小心肌坏死面积[5]。我们以往的实验也证实电针内关穴可明显降低缺血—再灌注损伤的程度,对心肌细胞有着良好的预防保护作用[6,7]。本实验通过在缺血前与缺血再灌注同时电针手厥阴心包经内关穴,使心肌组织中NO、NOS与同工酶中cNOS的活性增强,从而减轻了心肌缺血再灌注损伤的程度,对心肌细胞有良好的保护作用。
线粒体的超微结构在1952年有了详尽的描述,它是人体最基本最重要的细胞器之一,由内膜、外膜、嵴(嵴突)、外周间隙、嵴间隙、基质等组成了一个封闭的膜系统。线粒体具有极其复杂的结构和生化功能,因此其超微病变也是多方面的,由于代谢上的变化,可引起形态上的异常,而线粒体也是对各种毒性反应特别敏感的细胞器,生理病理的反应是十分复杂的。表现在代谢的变化和缺血性损伤的反应两个方面[8]。实验研究证明离体心脏在体外有氧灌注条件下,结扎冠状动脉,在超过一定生理时限后(约20~30min)再开放灌注,则出现心肌细胞内线粒体高度肿胀、水肿、嵴分离、断裂或形成大小不等的空泡。心肌梗死患者尸检早期取材的标本在电镜下观察到,心肌细胞内线粒体广泛肿胀、水肿、嵴分裂,并形成大小不等的空泡[9]。我们的研究结果显示假手术组肌纤维排列整齐,线粒体丰富,未见水肿及空泡变;模型组变化明显,线粒体水肿、空泡变、线粒体膜破裂,嵴消失,线粒体嵴致密变性;电针内关组大多数线粒体正常,嵴排列整齐,仅见部分轻度水肿;电针列缺组和电针合谷组线粒体均出现水肿、变性,空泡变,嵴紊乱。说明电针厥阴经内关穴明显改善了心肌细胞线粒体的损伤状态,这种作用在电针肺经的列缺穴及大肠经的合谷穴时不太明显,从而也证实了电针对心肌细胞的保护作用是与经脉(穴)脏腑间的特异联系分不开的。
【参考文献】
1 丁钢,黄永麟.心肌缺血再灌注时一氧化氮与心功能的关系.心血管学进展,1999,20(5):287-289.
2 Silver MD.Cardiovascular pathology.New York:Churchill Livigstone,1983,50-51.
3 Dinerman JL,Lowenstein CJ,Snyder SH.Molecular mechanisms of nitric oxide regulation.Potential relevance to cardiovascular disease.Circ Res,1993,73(2):217-222.
4 刘林.一氧化氮在心血管系统疾病中的作用和地位.第二军医大学学报,2002,23(1):90-92.
5 Johnson G,Tsao PS,Mulloy D,et al.Cardioprotective effects of acidified sodium nitrite in myocardial ischemia with reperfusion.J Pharmacol Exp Ther,1990,252(1):35-41.
6 严洁,田岳凤,林亚平,等.电针内关对心肌缺血再灌注损伤肌酸激酶及丙二醛的影响.湖南中医学院学报,2000,20(3):62-63.
7 田岳凤,林亚平,严洁,等.电针内关对心肌缺血-再灌注损伤预防保护作用的实验研究(Ⅰ)——对CK、ET、MDA、NO、NOS等的影响.中国中西医结合急救杂志,2002,9(1):12-14.
8 洪涛.生物医学超微结构与电子显微镜技术.北京:人民卫生出版社,1980,337-345.
9 谷伯起.心血管病理学.北京:人民卫生出版社,1992,62-68.
基金项目:湖南省自然基金资助项目(NO.OOJJYI006S)
作者单位: 410007 湖南长沙,湖南中医药大学针推系
(编辑:周 蕊)