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【摘要】 目的 探讨病毒性肝炎患者血清中一氧化氮（NO）浓度、肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）的含量水平及它们在病毒性肝炎病理机制中的作用。方法 用硝酸还原酶法测定NO浓度，采用双抗体夹心ELISA法测定TNF-α浓度和IL-1β浓度，包括丙肝患者、乙肝大三阳（HBsAg阳性、HBeAg阳性、HBcAb阳性）患者、乙肝小三阳（HBsAg阳性、HBeAb阳性、HBcAb阳性）患者和健康对照组。结果 血清中NO、TNF-α、IL-1β的水平，丙肝患者、大三阳、小三阳患者与健康对照组比较差异有统计学意义；NO、TNF-α含量，大、小三阳患者差异有统计学意义；IL-1β两者差异无统计学意义。结论 NO、TNF-α、IL-1β可能参与了病毒性肝炎的炎性损伤过程。
【关键词】 病毒性肝炎患者；一氧化氮；肿瘤坏死因子；白细胞介素
Relationship between NO， TNF-α and IL-1β in serum of patients with virtus hepatitis
ZHOU Yan.Central Hospital of Huangpu，Shanghai 200001，China
［Abstract］ Objective To study the level of NO，TNF-α and IL-1β in serum of patients with virtus hepatitis and its clinical significance.Methods NO，TNF-α and IL-1β were determined by biochemical and immunological method.Patients were divided into 4 groups according to hepatitis markers determined by ELISA:HCV（+）（group A）；HBsAg（+），HBeAg（+），HBsAg（+）（group B）；HBsAg（+），HBeAb（+），HBcAb（+）（group C）；individuals with negative （control group）.Results The level of serum NO，TNF-α and IL-1β of patients in group A，B and C were significantly higher than that in control group.The difference of the levels of NO，TNF-α and IL-1β was not significant between group B and group C.Conclusion NO，TNF-α and IL-1β may participate in liver damage of virtus hepatis.
［Key words］ virtus hepatitis；nitros oxide；tumor necrosis factor；interleukin
病毒性肝炎是一种感染人数众多，危害极大的传染性疾病，病毒对肝脏的损伤机制错综复杂，本文检测病毒性肝炎患者血清中TNF-α、IL-1β和NO的水平，通过对这些数据的分析来探讨它们在病毒性肝炎病理机制中的作用。
1 资料与方法
1.1 一般资料 我院2005年1～11月收治129例病毒性肝炎患者（包括长宁区中心医院同期25例丙肝患者），男63例，女66例，年龄18～85岁，平均51岁，其中丙肝患者43例，乙肝大三阳患者42例，乙肝小三阳患者44例；静脉采血3 ml，分离血清冰冻备用。设健康对照组43例，男22例，女21例，平均年龄45岁，为我院体检三对半、丙肝指标皆为阴性的健康人群，静脉采血3 ml，分离血清备用。
1.2 方法和步骤 以晶美微生物工程（北京）有限公司提供的一氧化氮（NO）试剂盒（酶法）检测患者血清中的NO的含量。操作步骤如下：（1）准确吸取待测血清0.1 ml及标准品（KNO3标准100.0 μml/L）、双蒸水（作为空白管），再加入磷酸盐缓冲液、硝酸还原酶各0.1 ml，轻轻混匀，37 ℃水浴1 h。（2）再加入显色剂混匀，室温放置10 min。（3）比色，530 mm波长，以双蒸水空白调零，读取各管吸光度值。人血清NO浓度为50～110 μml/L。人TNF-α ELISA试剂盒，人IL-1β ELISA试剂盒检测患者血清中的肿瘤坏死因子（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）。操作步骤如下：（1）除空白孔外，分别将标本或不同浓度标准品（100 μml/孔）加入相应孔中，用封板胶封住反应孔，37 ℃孵箱孵育90 min，洗板。（2）除空白孔外，加入生物素抗体工作液（100 μl/孔）封住板孔，37 ℃孵箱孵育60 min，洗板。（3）加入酶结合物工作液（100 μl/孔）封住板孔，37 ℃孵箱孵育30 min，洗板。（4）加入显色剂（100 μl/孔），37 ℃避光显色15～20 min。（5）加入终止液（100 μl/孔），混匀即刻测量OD450值。（6）然后在手工绘制的标准曲线上测出标本的浓度。
1.3 统计学方法 检测结果均以均数±标准差（x±s）表示；计量资料组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 对照组、丙肝组、乙肝大三阳组、乙肝小三阳组结果比较 NO含量：丙肝组、大三阳组、小三阳组与对照组比较差异有显著统计学意义（P<0.01）。TNF-α含量：丙肝组、大三阳组与对照组比较差异有非常统计学意义（P<0.01），小三阳组与对照组差异无统计学意义（P>0.05）。IL-1β含量：丙肝组与健康对照组比较差异有显著统计学意义（P<0.01），大三阳组、小三阳组与健康对照组比较差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
2.2 乙肝大三阳组与乙肝小三阳组结果比较 NO、TNF-α含量，大三阳组与小三阳组比较差异有显著统计学意义（P<0.01）；IL-1β含量，大、小三阳组比较差异无统计学意义（P>0.05）。 表1 各种病毒性肝炎的NO、TNF-α、IL-1β的水平比较 注：与对照组比较，*P<0.01，△P<0.05
3 讨论
肝炎病毒（丙肝、乙肝）通过各自特异性发病机制造成肝脏受损后，在肝炎发生发展过程中出现一系列反应，激活库普弗细胞，产生和释放细胞因子（TNF-α、IL-1β等）和NO。TNF-α、IL-1β和NO等具有直接肝细胞毒性作用而损伤肝细胞，其中TNF-α发挥着关键与核心作用，其他物质则发挥着协同辅助式的增强作用，使肝损伤进一步加强。TNF-α是一种多态性激素，主要由单核巨噬细胞所产生，又称恶病质素，它具有双重的生物学作用，一方面TNF-α是机体免疫防护的重要介质，另一方面TNF-α可参与机体的病理损伤，它参与肝病的免疫病理反应及炎症反应导致肝病发展。白细胞介素-1（IL-1）又称淋巴细胞激活因子，分为TNF-α、IL-1β，它们由不同的基因所表达，血液中的IL-1主要为单核细胞和巨噬细胞所产生的IL-1β。IL-1β含量升高，表明机体内有组织损伤或者感染产生。肝炎病毒（HBV和HCV）与其感染后产生的抗体形成的免疫复合物可使机体免疫系统活化，可刺激肝脏内的单核-巨噬细胞合成、分泌大量TNF-α，TNF-α在体内也可诱导IL-1β的产生，而IL-1β则增强TNF-α的活性，二者之间密切相关。在丙肝患者肝细胞中证明有高水平的TNF-α、IL-1等的表达［1］。在IL-1β与TNF-α的作用下，单核细胞与血管内皮细胞又可产生其他炎症因子，一方面参与机体的免疫调节，另一方面也参与病理损害［2］，因此，降低病理性肝炎患者TNF-α和IL-1β的过多分泌，有望缓解肝脏的损伤。Geneva-Popova用ELISA方法动态观察TNF-α、IL-1β的水平在急性乙肝患者血清中显著升高，然后缓慢下降，在患者恢复期回到较正常水平。在住院后HBsAg被清除患者血清中的TNF-α、IL-1β等与HBsAg携带者血清比较，有高水平的表达，说明这些细胞因子在乙肝患者血清中有重要的病毒清除作用［3］。NO是一种内源性血管扩张剂，对肝细胞功能、肝脏毒性及肝硬化的血流动力学改变均有重要影响。在本次试验中，丙肝、乙肝患者血清中NO含量与健康对照者差异呈显著性，比健康组明显为高，其机制可能是库普弗细胞在肝炎病毒刺激下释放IL-1β和TNF-α，目前认为TNF-α是NO合成的一个重要调节者，参与肝脏内皮细胞中NO的诱导合成，起正相调节作用。此时肝细胞有诱导型NOS表达，NOS是NO合成的关键酶，催化产生NO。有关NO与肝细胞毒性作用有两种截然不同的观点：在本试验中肝损伴有NO升高，释放的NO捕捉活性氧，并抑制TNF-α对肝的损伤作用，故对肝脏有保护作用；也有学者认为NO是毒素或某些肝细胞毒性药物诱导的肝毒性递质，在药物诱导代谢和肝毒性中具有重要作用。此外，NO生成过多可产生过氧亚硝基盐ONOO-释出OH-，损伤肝组织［4］。本次试验提示丙肝、乙肝（大三阳、小三阳）患者血清中TNF-α、IL-1β活性、NO水平均较健康对照组明显为高。这些结果反映了肝组织不断受肝炎病毒刺激使肝内库普弗细胞不断大量产生TNF-α、IL-1β和NO，从而单独或共同发挥着持续性的肝损伤作用，继而导致肝病进一步发展。另一方面，TNF-α和 IL-1β有很强的抗病毒活性。它们在丙肝、乙肝患者血清中的水平较高，说明这些细胞因子的产生可能与T细胞与抗原之间的相互作用有关，也有可能是机体清除病毒的手段之一，可推断出当患者得到有效治疗后血清中TNF-α、IL-1β和NO水平逐渐下降，而随病情进展血清中三者水平明显上升。再者，通过本次试验可以看出HBeAg阳性的乙肝患者，TNF-α、NO明显高于阴性组，提示它们的含量与肝细胞坏死程度、肝炎活动性及病毒复制活跃程度密切相关。在大、小三阳患者血清中，IL-1β水平差异无统计学意义，IL-1β作为局部炎症介质能诱导出TNF-α相似的生理和代谢改变，但它的作用远远不及TNF-α明显，以本次试验推断，IL-1β水平对HBeAg阳性和HBeAg阴性患者影响机体功能差异无显著性。另外，在试验中笔者发现血标本明显溶血，高脂血症及黄疸也可导致NO、TNF-α、IL-1β观测值上升，因此，取标本应避免这些因素的干扰，以免影响试验结果。综上所述：检测血清中TNF-α、IL-1β和NO的水平对于判断病毒性肝炎的炎症活动性和预后具有一定的实用价值。当肝炎病变程度越高，TNF-α、IL-1β和NO含量越高，它们能较准确地反映慢性肝炎的病变程度，尤其是NO的水平更早于ALT的水平，NO检测将可能成为肝功能等检查的重要项目之一。它们对肝炎、肝硬化、肝功能损伤机制的探讨、病情轻重的评价及治疗均有重要的临床意义。
【参考文献】
1 Kasprzak A，Zabel M.Expression of cytokines（TNF-α，IL-1 and IL-2）in chronic hepatitis C:comparative hybridocytochemical and immunocytochemical study in children and adult patients.Journal of Histochemistry and Cytochemistry，2004，52（1）:29-38.
2 孙文良，孙立煌，方海林，等.病毒性肝炎患者IL-1、IL-6、和TNF-α活性的控测.中华微生物学和免疫学杂志，1994，14（3）:187.
3 Geneva-Popova M.Study on proTNF lammatory cytokines（IL-1beta，IL-6，TNF-alpha）and IL-2 in patients with acute hepatitis B.Folia Med（Plovdiv），1994，41（1）:78-81.
4 韩德伍.肠源性内毒素血症所致“继发性肝损伤”的临床根据.世界华人消化杂志，1999，12（7）：391.
作者单位：200001 上海，上海市黄浦区中心医院