点击显示 收起
【摘要】 目的 研究草珊瑚总黄酮的提取工艺。方法 以草珊瑚为原料，用乙醇为溶剂，利用超声波辅助提取和水浴法提取草珊瑚总黄酮，利用L9（33 ）正交实验方法优化总黄酮提取工艺，采用单因素实验，测定了乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度等单因素实验，考察总黄酮提取率与各因素的关系。根据单因素实验得出的显著条件进行正交设计，确定最佳工艺条件。结果 超声波法的最佳工艺条件为乙醇浓度50%、料液比1∶15、提取时间45 min，根据确定的最佳工艺条件，按实验中的测定方法测得提取的总黄酮含量为69.25 mg/g。水浴法的最佳工艺条件为乙醇浓度50%、料液比1∶20、提取温度80 ℃、提取时间2 h，按实验中的测定方法测得提取的总黄酮含量49.60 mg/g。结论 超声波提取不仅在时间上比水浴提取大大缩短，而且实验过程易于控制，黄酮提取率也比水浴提取提高28.38%。
【关键词】 草珊瑚；总黄酮；提取工艺；含量
Content detection and extraction of total flavonoids in sarcandra glaber
FAN Jia-you,YU Jian-ping,LIU Jian.Life Science Institution of Guizhou University,Guiyang 550025,China
［Abstract］ Objective To optimize the extraction process of the flavonoids from sarcandra glaber.Methods Used sarcandra glaber as raw materials，took ethanol extraction methods and used ultrasonic water bath to extract the flavonoids，then used L9（33） orthogonal experiment to optimize the extraction process of flavonoids.One of the experiments is the single factor experiment.According to the given conditions and measured flavones，what we will do is to have single factor experiments about different concentrations of ethanol，feed ratio，extraction time and temperature.According to the remarkable conditions from single factor experiments，we will have an orthogonal design and then select the best conditions.Results The optimum conditions of ultrasonic methods are for the concentration of 50 percent ethanol，feed rate 1∶15，the extracted time 45 minutes，the flavones in 69.25 mg/g.The optimum conditions of water bath for ethanol methods are for concentration of 50 percent，feed rate 1∶20，the extracted temperature 80 ℃ and the flavones in 49.60 mg/g.Conclusion The time used in ultrasonic extraction is greatly shorter than that of water bath and the experiment is easier to control than that of water bath，and the extraction rate of flavonoids also raise 28.38% than that of water bath.
［Key words］ sarcandra glaber；flavonoids；extraction process；content
随着草珊瑚在医药、兽药、保健食品及保健用品领域中的应用越来越广泛，对其有效成分的提取分离显得越来越重要。黄酮类化合物是草珊瑚中含量最多、最主要的活性成分之一。目前，对草珊瑚总黄酮的提取分离工艺技术研究尚未见有详细报道，本学位论文拟对草珊瑚总黄酮提取分离工艺技术进行较系统的研究并筛选最佳新技术新工艺。采用正交实验方法考察沸水提取法及乙醇提取法对草珊瑚总黄酮提取效果的影响；采用中药高新工程技术大孔吸附树脂对草珊瑚总黄酮进行分离纯化研究，以确定草珊瑚总黄酮最佳提取分离工艺条件及方法。以确定的草珊瑚总黄酮最佳提取工艺对不同季节采收的草珊瑚中总黄酮含量的动态变化，草珊瑚自然存放时间不同对总黄酮含量的影响，贵州草珊瑚根、茎、叶中总黄酮的不同含量进行动态变化研究，以确
定草珊瑚原料的最佳利用时机。从而为生产中最有效的开发利用草珊瑚，获得草珊瑚总黄酮的最大提取率，发挥草珊瑚的最大经济效益提供实验依据及指导，以达到提升草珊瑚药、食用产品的质量档次，使其更具三效（高效、速效、长效），三小（剂量小、毒性小、不良反应小），三便（便于贮藏，便于携带，便于服用）的特点，使其产品能走出国门、出口创汇，有着重要的经济和社会意义［1］。
1 材料与方法
1.1 实验材料 原料：草珊瑚购于贵阳花果园药材市场；NaNO2（固体）（重庆北碚精细化工厂）；95%的乙醇溶液（分析纯） （遵义国营化学试剂厂）；Al（NO3）3（固体）（汇源化工有限公司）；NaOH（固体）（天津市化学试剂六厂三分厂）。
1.2 实验器材 HH-S2s型恒温水浴锅（金坛市环保仪器厂）；UV2755B紫外可见分光光度计（上海分析仪器总厂）；抽滤机（金宇机械有限公司）；JY88（96）-IIN型数控超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技有限公司）；FA1004型电子分析天平（上海天平仪器厂）。
1.3 实验方法
1.3.1 黄酮类化合物的超声波法提取研究 超声波提取方法：取原料草珊瑚5 g按实验要求的料液比加入乙醇，放入准备好的烧杯中，超声波提取，抽滤液体，取0.3 ml加入25 ml容量瓶中，再在25 ml容量瓶中加入1 ml 5%的NaNO2溶液，等待6 min后，再在25 ml容量瓶中加入0.5 ml 5%的Al（NO3）3溶液，等待6 min后，再在25 ml容量瓶中加入10 ml 5% NaOH溶液，并加入60%乙醇溶液定容。等待15 min后在500 nm处检测吸光度，然后记录数据［做空白对比的不加Al（NO3）3］。
超声波提取过程：（1）称取草珊瑚5 g分别装入准备好了的烧杯中，在烧杯上填上编号，并记录好数据。（2）用95%乙醇分别配制50%、60%、70%、80%的乙醇，按正交实验设计搭配装入对应号的锥形瓶中。（3）根据以上配置好的原料，放入超声波仪器中进行提取。（4）将以上提取物过滤，将滤液按照实验方法测出吸光度，并记录好数据。
1.3.2 黄酮类化合物的水浴提取研究 取原料草珊瑚5 g 按实验要求的料液比加入乙醇，放入锥形瓶中，水浴锅加热，抽滤液体，取0.3 ml加入25 ml容量瓶中，再在25 ml容量瓶中加入1 ml 5%的NaNO2的乙醇溶液，等待6 min后，再在25 ml容量瓶中加入0.5 ml 5%的Al（NO3）3的乙醇溶液，等待6 min后，再在25 ml容量瓶中加入10 ml 5% NaOH的乙醇溶液，并加入60%乙醇溶液定容。等待15 min后在500 nm处检测吸光度，然后记录数据［作空白对比的不加Al（NO2）3］。
水浴提取的实验过程为：（1）称取草珊瑚5 g分别装入准备好了的锥形瓶中，在锥形瓶上填上编号，并记录好数据；（2）用95%乙醇分别配制50%、60%、70%、80%的乙醇，按正交实验设计搭配装入对应号的锥形瓶中，并用保鲜膜密封好；（3）把锥形瓶放入已准备好的一定温度的水浴中加热，2 h后取出抽滤液体转入干净的烧杯中，并用保鲜膜密封好；（4）将以上的提取物过滤，将滤液按照实验方法测出吸光度，并记录好数据。
2 实验结果与讨论
2.1 标准曲线的制备 见图1。从芦丁对照储备液中分别吸取1 ml，放入1号、2号容量瓶中（25 ml），各加60 %乙醇至5 ml，加5%NaNO2溶液1.0 ml，摇匀放置6 min，再加10%Al（NO3）3 溶液0.5 ml（空白对照不加），摇匀再放置6 min，加4%NaOH溶液10 ml，摇匀放置15 min，从400～600 nm处测吸光值：可得出芦丁在500 nm处存在最大吸收峰。
回归方程：A=0.0095C+0.0016,线性范围为0～59.82 μg/ml，相关系数R2=0.9991
图1 标准工作曲线
首先，精密称取芦丁对照品18.6 mg，置于100 ml量瓶中，加60%乙醇溶解至刻度，摇匀即得对照品溶液。然后，分别精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0和5.0、6.0、7.0、8.0 ml对照品溶液置于25 ml容量瓶中，各加60 %乙醇至5 ml，加5%NaNO2溶液1.0 ml，摇匀放置6 min，再加10%Al（NO3）3 溶液0.5 ml，摇匀再放置6 min，加4%NaOH溶液10 ml，摇匀放置15 min，在500 nm波长处测定吸光度值，以同法配制空白（不加硝酸铝）对照。显色剂的配置：含量测定，标准曲线的绘制。所用试剂均为分析纯，4%NaOH乙醇溶液（200 ml）： 称取8 g NaOH置入烧杯中，用200 ml 60%乙醇溶解。10% Al（NO3）3乙醇溶液（25 ml）：称取2.5 g Al（NO3）3置于烧杯中，用25 ml 60%乙醇溶解。5%NaNO2乙醇溶液（50 ml）：称取2.5 g NaNO2置于烧杯中，用50 ml 60%乙醇溶液溶解［2］。
2.2 黄酮提取过程
2.2.1 提取方法 （1）超声波提取：精密称取干燥、粉碎的草珊瑚粉末5 g置于烧杯中，按实验要求的料液比加入乙醇溶液浸泡，然后用超声波提取。
（2）水浴法提取：精密称取干燥、粉碎的草珊瑚粉末 5 g 置于锥形瓶中，按实验要求的料液比加入乙醇溶液浸泡并用保鲜膜密封好，然后放在水浴锅上加热2 h，滤去残渣。
2.2.2 样品测定 精密吸取黄酮提取液 0.3 ml于25 ml容量瓶中，分别加入60%的乙醇6 ml，再加入5% NaNO2 1.0 ml，摇匀放置6 min，加入10%Al（NO3）30.5 ml（做空白对照的不加），摇匀放置6 min，加入4%NaOH 10.0 ml，加入60%的乙醇定容至刻度。摇匀放置15 min在500 nm处测吸光度，利用标准回归方程计算出浓度。得到标准曲线回归方程：A=0.0095C + 0.0016，相关系数R2=0.9992，根据标准方程可以推导出C=（A-0.0016）/0.0095，C为物质浓度（单位为μg/ml），提取黄酮的质量（mg）=C·25/3·10·V·10-3,提取总黄酮含量=提取黄酮的质量（mg）/原料草珊瑚质量（g）。
2.3 超声波法提取黄酮的单因素实验设计及正交实验数据处理
2.3.1 乙醇浓度对超声波法提取效果的影响 在五个烧杯中各取5 g草珊瑚放入，分别用40%、50%、60%、70%、80%乙醇溶液50 ml浸泡后超声波萃取15 min，按以上的含量测定方法测定吸光度值。见表1。表1表明：随着乙醇浓度的增加，黄酮的提取率也逐渐增加，但是当乙醇浓度超过60%的时候，黄酮的提取率反而降低，是因为随着乙醇浓度的增大，会使提取粗品中杂质含量增加，黄酮成分含量反而降低。表1 乙醇浓度对草珊瑚黄酮提取的影响
2.3.2 料液比对黄酮提取效果的影响 在四个烧杯中各取5 g草珊瑚放入，用60%的乙醇，料液比分别1∶5、1∶10、1∶15、1∶20浸泡后超声波萃取15 min，按含量测定方法测定吸光度值。见表2。表2 料液比对草珊瑚黄酮提取的影响表2可见，浸提固液比在1∶10至1∶20的范围内，浸提固液比在1∶15时提取率最高，但随后增加溶剂的量对提取率的变化不大，在实际操作中，当浸提固液比过小时，提取液偏少，不利于过滤分离，因此选择浸提固液比在1∶15较为合适。
2.3.3 超声波萃取时间对黄酮提取效果的影响 在四个烧杯中各取5 g草珊瑚放入，在料液比1∶10，60%乙醇条件下选择时间分别为15 min、30 min、45 min、60 min进行超声波萃取，按含量测定方法测定吸光度值。见表3。 表3 提取时间对黄酮提取的影响由表3可见，随超声波提取时间15~30 min，吸光度增长0.046，增长程度一般，而提取时间30~45 min时，吸光度增加了0.102，幅度大增，而提取时间45~60 min时，吸光度增长了0.012，增长程度大大降低。由此可以看出，再增加超声波提取时间，吸光度增速出现先增强再逐渐减缓趋势。造成提取物在超声作用达到一定时间后，提取率增加缓慢或呈下降趋势的原因可能是在长时间超声作用下，提取率逐渐向极限值靠近，致使提取率增幅降低。同时超声作用时间太长，会使提取粗品中杂质含量增加，有效成分含量反而降低，影响提取物有效含量。故45 min提取时间是最好的工艺条件。
由以上单因素实验可得出几个在实验过程中，对实验结果有显著作用的因素，他们分别是乙醇浓度 50%、60%、70%，料液比1∶10、1∶15、1∶20，提取时间15 min、30 min、45 min，运用这些条件做出提取工艺参数设计表（表4），为下面的正交实验做好准备条件。见表5、6。
由表5可看出R料液比＞R乙醇浓度＞R提取时间，所以本实验料液比作为主要因素，K1、K2、K3中数据最大者对应的水平为最佳水平，即转化率最高。本实验的最佳水平组合是A1B2C3，即最佳工艺条件为乙醇浓度50%、料液比1∶15、提取时间45 min。表4 提取工艺参数设计表表5 L9（33）提取工艺条件正交实验结果表表6 最佳工艺条件提取由表6可看出黄酮含量 69.25 mg/g，比正交实验中的A1B2C2（乙醇浓度50%、料液比1∶15、提取时间30 min）所提取出的黄酮含量还高，证明本次正交设计实验结论是合理的。
2.4 水浴法提取黄酮的单因素实验设计及其正交实验数据处理
2.4.1 乙醇浓度对水浴法提取效果的影响 在四个锥型瓶中各取5 g草珊瑚放入，分别用50%、60%、70%、80%乙醇溶液75 ml浸泡后，水浴提取2 h，按以上的含量测定方法测定吸光度值（表7）。表7 乙醇浓度对水浴法提取效果的影响由表7可看出：随着乙醇浓度的增加，黄酮的提取率也逐渐增加，但从60%～70%，吸光度增长幅度变小即提取的黄酮含量增长幅度变小，当乙醇浓度超过80%的时候，黄酮的提取率反而降低，提取的黄酮含量变小，是因为随着乙醇浓度的增大，会使提取粗品中杂质含量增加，有效成分含量反而降低，影响提取物有效含量。
2.4.2 提取温度对水浴法提取黄酮效果的影响 在四个锥形瓶中各取5 g草珊瑚放入，在料液比1∶20，60%乙醇条件下选择60 ℃、70 ℃、80 ℃、85 ℃进行水浴法提取，按含量测定方法测定吸光度值（表8）。
由表8可看出在乙醇浓度60%、料液比1∶20的不变条件下，随着提取温度的升高，吸光度值也在不断的增长，60 ℃~70 ℃的增长程度是最大的，吸表8 提取温度对水浴法提取黄酮效果的影响光度增长最大，但随着温度的继续升高，吸光度的增长程度越来越小，是因为随着温度的增加，提取出来的黄酮参与了其他的反应，故提取的增长率变小了（温度也不易太高，体积将会大量减少）。
2.4.3 料液比对水浴法总黄酮提取效果的影响 在四个锥形瓶中按料液比各取草珊瑚放入，在提取温度70 ℃、乙醇浓度60%条件下选择料液比分别为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30进行水浴法提取，按含量测定方法测定吸光度值（表9）。表9 料液比对水浴法总黄酮提取效果的影响表9可见，浸提固液比在1∶15至1∶20的范围内，吸光度最高，但随后增加溶剂的量对吸光度的变化不大，在实际操作中，当浸提固液比过小时，提取液偏少，不利于过滤分离，因此选择浸提固液比在1∶20较为合适。
由以上单因素实验可得出几个在实验过程中，对实验结果有显著作用的因素，他们分别是乙醇浓度50%、60%、70%，料液比1∶15、1∶20、1∶25，提取温度60 ℃、70 ℃、80 ℃，运用这些条件做出提取工艺参数设计表（表10），为下面的正交实验做好准备条件，见表11、12。表10 提取工艺参数设计表表11 水浴法提取黄酮L9（33）实验表表12 最佳工艺条件确定表由表11可看出R料液比＞ R提取温度＞R乙醇浓度，所以本实验料液比作为主要因素，K1、K2、K3中数据最大者对应的水平为最佳水平，即转化率最高。本实验的最佳水平组合是A1B2C3，即最佳工艺条件为乙醇浓度50%、料液比1∶20、提取温度80 ℃。
由表12可看出黄酮含量49.60 mg/g，比正交实验中的A1B2C2（乙醇浓度60%、料液比1∶20、提取温度80 ℃）所提取出的黄酮含量还高，证明本次正交设计实验结论是合理的。
3 结论
本文是通过对两种不同的提取方法对草珊瑚进行总黄酮的提取的研究，以便为以后的提取研究找出合适的实验条件及设计。 两种不同的方法，同样的浸提试剂，所提取的黄酮量是超声波法提取的多于水浴法提取的，实验得出结果：超声波法的最佳工艺条件为乙醇浓度50%、料液比1∶15、提取时间45 min，根据确定的最佳工艺条件，按实验中的测定方法测得提取的总黄酮含量为69.25 mg/g。水浴法的最佳工艺条件为乙醇浓度50%、料液比1∶20、提取温度80 ℃、提取2 h，按实验中的测定方法测得提取的总黄酮含量49.60 mg/g。
超声波辅助提取的优点有： （1）所用的提取时间较水浴法缩短了两倍多；（2）实验过程中不用像水浴法一样，要注意温度的控制［3］；（3）所提取的黄酮含量比水浴提取高了28.38%。
提取黄酮量,超声波法提取的多于水浴法,分析原因可能是：（1）超声波的空化作用对细胞膜的破坏有助于总黄酮的释放与溶出；（2）超声波使浸提剂和提取物不断震荡，有助于溶质的扩散；（3）超声波的热效应使介质温度基本维持在60 ℃，对草珊瑚有水浴效果；草珊瑚分布广泛，资源丰富，成分多样。药理作用广泛、毒性小，用于治疗多种疾病，无明显副作用。目前已有厂家生产了针、片等剂型，日用化工厂以此为原料，制成草珊瑚牙膏。产生了较好的社会和经济效益。从文献资料［4］看来，尽管已进行了生药学、化学成分、药理、临床等方面的研究，但是仍有许多问题有待进一步深入研究。
【参考文献】
1 郁建生，李英伦.草珊瑚研究进展.安徽农业科学，2005，33（12）：2390-2392.
2 江苏新医学院.中药大辞典.上海：上海科学技术出版社，1997，57.
3 徐志杰.草珊瑚的研究概况.江西中医学院学报，1994，1：36-37.
4 宋秋华，张磊，梁飞，等.黄酮类化合物提取和纯化工艺研究进展.山西化工，2007，27（4）：24-27.
（编辑：江 枫）
作者单位：550025 贵州贵阳，贵州大学生命科学学院