原位末端标记技术的发展及在临床诊断研究中的应用

　　关键词 引物原位杂交标记；分子遗传学；荧光原位杂交；诊断学

　　染色体结构和数量的变化与畸形和精神损害相关,因此染色体评价已经变成了产前诊断［1］中不可缺少的部分。近15年来,荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）已经被广泛应用于肿瘤研究中的基因扩增、易位重排及缺失等的检测，在肿瘤诊断和鉴别诊断、预后和治疗监控等方面都有重要意义。然而在某些情况下探针的获得比较困难，只有有限的探针可以通过商业的手段得到［2］。在20世纪80年代出现了一种新的技术—原位末端标记技术（Primed in situ labeling,PRINS），因其具有高效性、特异性、敏感性、廉价等特点，有替代FISH的可能性。

　　1 PRINS技术的兴起

　　原位末端标记技术（primed in situ labeling,PRINS）,一种新基因分析的方法,最初由Koch等［3］建立，包含了PCR和FISH二种方法的特点,在染色体重排方面可选择性的代替FISH技术,在使用PRINS技术时,用简单的寡核苷酸引物代替探针,原位标记染色体,消除了制备DNA探针困难的问题［4］。

　　2  PRINS技术的原理

　　PRINS是由未标记的序列特异性寡核苷酸探针（包括寡核苷酸引物或克隆的探针）与固定在细胞内的靶DNA互补序列，在聚合酶的驱动下，带有标记的脱氧核苷酸（FITC-dUTP或半抗原-dUTP）和dATP、dCTP、dGTP的延伸，依赖标记，新合成的DNA就能直接的或间接的被探测［5］， Koch等［6］使用寡核苷酸引物成功的标记了染色体特异性α卫星DNA ，随后他们构建了一系列特异性的寡核苷酸引物来鉴定人类的每个染色体（6、19、20染色体除外）。

　　3 PRINS技术的发展

　　PRINS技术检测<2kb染色体序列有一定的难度，后来发展成了间接C-PRINS（cycling-PRINS，C-PRINS）［7］、直接C-PRINS［8］，以保证消除在退火和延伸过程中因不断的温度变化产生的非特异信号［9］。这二种改进的方法，从敏感性和阳性信号的强度来说，都要优于单引物常规PRINS方法，而且并不增加染色的背景。二种改进的PRINS方法相比，直接C-PRINS比间接C-PRINS速度更快，敏感性更高，同时也发现除上述的样品制备的时间影响背景外，降低退火温度，同样能改善染色的背景问题。

　　Terkelsen等［10］建立了重复引物原位标记技术（repeated PRINS），重复进行PRINS反应，使信号强度明显提高。荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）也是一种快速发展地探查非分裂细胞染色体不稳定性的方法，应用FISH技术可以观察间期核染色体的丢失和获得情况。Wilkens等研究发现，同时使用PRINS和FISH二种方法研究骨髓细胞染色体变化时，二种方法获得的结果有相关关系，使用PRINS最主要的优点是寡核苷酸的使用，它未进行任何标记比较廉价而且容易得到，使得PRINS的造价比FISH便宜大约10倍。相反FISH要准备合适的DNA探针以及检测探针所需的昂贵的试剂。FISH杂交通常过夜进行，半抗原标记PRINS大约需要30min，而荧光标记PRINS直接检测仅需要20min左右。由于原位末端标记技术的敏感性、高效性、廉价等特点有替代FISH或原位杂交的可能性。基于FISH的原理，还发展了多色原位引物标记（multicolor PRINS），可测定二个以上靶序列在DNA分子上的相互位置，且特异性比FISH还高。

　　4 PRINS技术的应用

　　PRINS方法学最初集中在用于细胞遗传学中检测非分裂细胞中染色体结构和数量的异常，该法可应用于出生前、出生后或胚胎移植前的中期及间期细胞的临床诊断,其在染色体研究和临床诊断中的重要作用可分为:①识别数目变异(三体21,13和18,特纳综合征);②染色体标记的检测;③亚端粒缺失的快速区别;④微缺失综合征的诊断(Prader Willi,Angelman和DiGeorg等综合征);⑤精子中的染色体研究;⑥胚胎移植前甄别普通非整倍体;⑦癌症细胞遗传学研究等［11］。

　　4.1 快速检测染色体数量和结构                                   

　　Koch等最先使用寡核苷酸引物标记染色体特异性α卫星DNA，而Pellester等在1995年证明这些特异性引物在检测相应染色体的结构和数量的异常时是行之有效的。此项技术飞速发展，主要用于21、13、18三体，特纳综合征的诊断，在此方面PRINS技术以高效性、特异性、敏感性、廉价等特点有替代FISH的趋势。

　　4.2 检测中高度重复序列及单拷贝序列                                    
　　PRINS最初只用于检测中心粒和端粒区等中高度重复区域序列的检测， PRINS技术用于检测染色体结构和异常之外，改进的PRINS方法为检测低拷贝和单拷贝的DNA序列提供了一个更大的应用领域。近几年应用PRINS技术检测的单拷贝序列主要包括X染色体Ⅸ因子［12］Y染色体p11.31p11.32 上SRY［13］，X染色体q26q27上的SOX3［14］基因。X染色体p21上DMD基因［15］，Y染色体p11.2 上的RBM和DAZ基因［16］。Cinti等在研究X染色体Ⅸ因子时与其他学者［17］一样都发现准备的细胞样品超过4d，PRINS染色的信号降低，背景就会升高，这种现象可以通过在-20℃冻存切片来解决。而且冻存的切片可以储存2年，且不影响实验结果。

　　4.3 肿瘤的细胞遗传学研究                                    
　　肿瘤发病中有遗传因素的存在，因此可以认为肿瘤是基因染色体异常引起的疾病。PRINS技术可以用来评价癌症中基因缺失，13q14和17p13染色体重排在白血病和淋巴瘤患者中，约50%患者的缺失经常发生在亚显微水平，核型表现是正常的。Augandhi等［18］在2002年应用PRINS技术成功测定了10个病例的p53和RB的缺失。谢民强等检测了15例鼻咽癌组织中3号和7号染色体的变化，结果表明染色体数目的变化可作为鼻咽癌诊断的重要参考指标。此外还有将PRINS技术应用于白血病的研究［19，20］等。

　　4.4  SV40 DNA相关研究                                    

　　应用SV40 DNA特异性引物检测恶性间皮瘤中SV40，表明SV40 在SV40抗原阳性的病例中可能是活化的［21］。

　　总之，除以上的应用外，PRINS技术在生物学方面也发挥着重要作用［22］，Yan等应用PRINS和FISH技术检测了适用于冰冻和石蜡组织切片中DNA或RNA的检测［23-25］。相信随着现代生物技术的发展， PRINS以其快速、廉价、灵敏等特点，会越来越适应现代生物科技发展的需要，必将在科学研究中发挥重要作用。

　　参考文献

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