survivin mRNA表达与乳腺癌血管生成

　　关键词 乳腺癌；凋亡抑制蛋白；血管生成相关因子；微血管密度；血管生成

　　摘要 目的  探讨survivin mRNA表达与乳腺癌血管生成的关系。方法 应用原位杂交检测survivin mRNA在97例乳腺癌组织、56例癌旁乳腺组织中的表达；通过免疫组化Elivision法检测endoglin标记的MVD记数的表达情况。结果  survivin mRNA在癌旁乳腺组织、乳腺癌组织中的阳性率分别为1.79％（1 / 56）、72.16%（70/97），后者的阳性率明显高于前者（P＜0.005）；survivin mRNA表达阳性组中endoglin－MVD显著高于survivin mRNA表达阴性组（P＜0.05）。结论  survivin mRNA参与了乳腺癌的血管生成。

　　mRNA EXPRESSION OF SURVIVIN AND BREAST CANCER WITH ANGIOGENESIS    
                              
　　Zhu Haiyan, Zhao Jing, Wang 　　Xianhua.

　　Department of Pathology, North China Coal Medical Colledge, Tangshan 063000, China

　　Key words breast cancer; apoptosis profilin; angiogenesis related factor; microvessel density; angiogenesis

　　Abstract  Objective  To study mRNA expression of survivin in the breast cancer with angiogenesis. Methods  mRNA expression of survivin was detected in 97 cases with breast cancer and 56 cases with neighboring noncancerous tissue with the in-situ hybridization method. Endglin-MVD was studied with the EliVision method of immunohistochemistry. Results  The positive rates of survivin mRNA level were 1.79%（1 / 56）、72.16%（70 /97）in the neighboring noncancerous tissue and breast cancer, the positive rates in the last group was higher than that in the former group（P＜0.005)；Endoglin-MVDs in survivin mRNA positive tumors were significantly higher than those in survivin mRNA negative tumors(P＜0.05). Conclusion   Survivin mRNA level is correlated with angiogenesis in breast cancer.

　　近年来对survivin和endoglin的研究认为，survivin是最小的凋亡抑制蛋白，它参与肿瘤新生血管的形成，同时又抑制细胞凋亡间接促进肿瘤生长；endoglin是极为重要的一种血管生成相关因子，它可能与肿瘤的进展有关，可作为肿瘤新生血管的标志物。目前大量的研究表明，乳腺癌的生长和转移依赖于新生血管生成［1］。我们对survivin mRNA在乳腺癌中的表达及endoglin(CD105)标记的微血管密度（MVD）进行了检测，旨在探讨survivin与乳腺癌血管生成的关系。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料                                    

　　随机收集我院2003年1月—2004年1月具有完整临床及病理资料的乳腺癌标本97例，中位年龄51岁；56例对照组，中位年龄52岁，取自2004年1月—2004年5月乳腺根治术标本中癌旁乳腺组织（距离癌组织＞4cm）。患者均为女性，乳腺癌患者术前未经任何化疗和抗肿瘤治疗。每例乳腺癌的组织分型和临床分期按卫生部1988年制定的乳腺癌诊治规范。组织学类型：浸润性导管癌71例，其他26例。

　　1.2 试剂                                    

　　survivin原位杂交试剂盒购自武汉博士德公司；鼠抗人endoglin单克隆抗体购自北京中山生物技术有限公司。

　　1.3 方法                                    

　　标本经10%甲醛固定，石蜡包埋，4μm连续切片3张，行苏木精伊红（HE）染色、endoglin免疫组化染色及PBS（0.01mol/L，pH 7.4）代替一抗做空白对照。免疫组织化学采用Elivision法。实验步骤按试剂盒说明书进行。连续切片（厚5μm）2张，行survivin mRNA原位杂交及以PBS代替杂交液做空白对照。实验步骤按试剂盒说明书进行。

　　1.4 结果判定标准                                    
　　survivin mRNA主要为细胞浆着色，部分呈胞核着色。随机观察10个高倍镜视野，平均每高倍镜视野的阳性肿瘤细胞数≥10%即判断为阳性。

　　MVD计数标准参照文献［2］并略加修改，以与背景明显有别的任何一个棕色染色的内皮细胞或细胞丛作为一个血管，只要结构不相连续，分支结构也作为一个血管计数。先在100倍显微镜下寻找血管密度最高的5个区域作为“热点”,然后在200倍镜下计数MVD，5个区域的均值为MVD值。

　　1.5 统计学方法                                    

　　采用SPSS 12.0统计软件进行统计学处理。采用四格表χ2检验，t检验和方差分析。

　　2  结果

　　2.1  survivin mRNA的表达                                    
　　survivin mRNA主要定位于肿瘤细胞胞质，为粗细不一的棕黄色颗粒。实验结果显示癌旁乳腺组织仅1例表达，乳腺癌组织中70例为阳性。乳腺癌组织中survivin mRNA阳性率明显高于癌旁组，二组间比较差异有统计学意义（P＜0．005）。见表1。表1 survivin mRNA在癌旁乳腺组织及乳腺癌组织中的表达（略）

　　2.2 endoglin标记的MVD                                    

　　在癌旁乳腺组织及乳腺癌组织中的MVD值见表1。CD105阳性染色主要定位于血管内皮细胞的细胞膜和细胞浆，在癌细胞向间质浸润处微血管密度最强。 乳腺癌标本endoglin染色的切片中，阳性的内皮细胞多排列不规则，新生血管的分布并不均匀一致，在很大程度上局限于肿瘤实质边缘的间质，很少见到有明显的管腔。乳腺癌组织MVD显著高于癌旁乳腺组织，二组间比较差异有统计学意义（P＜0.01)。在有淋巴结转移的乳腺癌中MVD显著高于无转移的乳腺癌组织MVD。见表2。表2 survivin mRNA及 MVD的表达与临床病理因素的关系（略）

　　3  讨论

　　目前大量的研究表明，survivin与血管的生成有关，由此参与了肿瘤的转移扩散。血管生成是实体肿瘤生长和转移的重要因素，也是肿瘤的预后判断指标之一。乳腺癌等实体肿瘤的直径＞2mm时，为了维持恶性肿瘤无限制侵袭性生长，肿瘤必须依赖新生血管生成。

　　3.1  surviving mRNA在乳腺癌中表达的意义                                    
　　survivin是近年来新发现的一种生存素，也是一种凋亡抑制蛋白，定位于17q25，基因全长15kb，由4个外显子和3个内含子组成，主要通过直接或间接抑制Caspase活性而抗凋亡。它通过参与血管形成和对细胞周期G2/M的调控，促进肿瘤细胞的增殖和扩散［3］。survivin蛋白表达具有细胞周期性和明显的细胞选择性，通常只表达于胚胎和发育的胎儿组织及增殖旺盛的细胞［4］。研究表明，survivin在大多数常见肿瘤组织内都有不同程度的表达，阳性率为30%~100%［5］。本研究采用原位杂交方法检测了97例乳腺癌组织中survivin mRNA的表达，结果发现70例乳腺癌组织中survivin mRNA阳性（72.16%），而在癌旁乳腺组织中仅1例表达，二组间差异显著，高分化组endoglin-MVD数值明显低于中、低分化组（P＜0.05）；乳腺癌survivin mRNA的表达与淋巴结有否转移二者之间差异具有统计学意义,与Yu等［6］在胃癌组织的检测的结果基本一致；此外， survivin mRNA的表达与乳腺癌肿瘤的大小、TNM分期及患病年龄无关。综合以上的结果，survivin mRNA的高表达可考虑做为乳腺癌预后不良的客观指标。

　　3.2  endoglin－MVD在乳腺癌中表达的意义                                    
　　endoglin是转化生长因子β（TGF-β）家族受体复合物成分之一，是内皮细胞增殖相关膜抗原，在培养的高增殖活性内皮细胞和许多恶性肿瘤组织血管内皮细胞中高表达［7］。 endoglin在乳腺癌组织的血管内皮细胞中强表达，新生血管尤为明显，正常组织则弱表达［8］。并且与肿瘤的发生发展密切相关。我们的实验发现，在乳腺癌组的间质endoglin-MVD平均每一视野为（45.56±19.49），显著高于癌旁对照组的（9.86±2.98）（P＜0.01）。癌组织内endoglin-MVD的染色强度呈深棕色，绝大多数呈（），明显强于癌旁组。有研究也注意到，endoglin在乳腺癌组织的血管内皮细胞中呈强表达，新生血管尤为明显。在培养的具有高增殖活性的内皮细胞和许多恶性肿瘤组织的血管内皮细胞中高表达，正常组织内为微弱表达［9］。内皮细胞增殖、血管大量新生，是恶性肿瘤生长与扩散的基础。肿瘤的内皮细胞增殖是正常组织的20~2 000倍。endoglin在恶性肿瘤组织的血管内皮细胞中高表达与肿瘤的分期、转移、增殖显著相关［10，11］。我们的结果也为此观点提供了证据。在不同分化程度之间endoglin-MVD有明显差异，低分化组endoglin-MVD数值明显高于中、高分化组（P＜0.05）；有淋巴结转移的乳腺癌endoglin-MVD显著高于无转移者（P＜0.05）；乳腺癌endoglin-MVD随临床分期的升高有升高的趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。最近几年的临床研究认为，乳腺癌endoglin-MVD与远处转移有明显的相关性，即在术前和/或术中癌细胞从原位脱落的数量与MVD有关［12］。乳腺癌组织中，endoglin标记的MVD值与患者的生存期相关［11］ 。Akagi等［7］认为endoglin不仅可作为新生血管标志物，还可作为预测结肠癌危险性的有价值的标志物。Wikstrom［13］认为，CD105-MVD显著升高者能较好的预示淋巴结转移倾向。在我们的实验中，CD105-MVD与乳腺癌组织分化程度及淋巴结的转移有关。与患者的年龄、肿瘤的大小、组织学分型无关。

　　3.3   surviving mRNA表达与endoglin-MVD                                    
　　“肿瘤生长依赖于血管生成”的观点［14］已为广大的肿瘤学家们所公认。肿瘤的增殖和转移与肿瘤区的血管密度有着密切的关系。血管生成时，内皮细胞受生长因子刺激而分裂、移行，重塑，形成原始血管和开放的血管网，血管的形成确切的说取决于内皮细胞的生存和凋亡平衡的结果。 大量的研究表明，血管生成对肿瘤生长有重要作用，也与肿瘤侵袭和转移密切相关。内皮细胞增殖相关膜抗原endoglin由于其正向调控内皮细胞分裂、促进血管新生而成为新生血管的标志物。本研究发现，survivin mRNA表达阳性组中endoglin-MVD显著高于survivin mRNA表达阴性组，提示survivin mRNA与MVD密切相关（P＜0.01）。说明survivin能参与肿瘤血管的生成，促进肿瘤细胞的增殖和转移。其作用机制可能是：survivin作为一种凋亡抑制蛋白，阻止内皮细胞凋亡，是血管形成中生长因子诱导的保护性基因，维持血管内皮细胞的正常增殖，在体内血管形成过程中稳定血管结构。其具体机制还有待于进一步研究。

　　参考文献

　　［1］Li C, Guo B, Bernabeu C, et al. Angiogenesis in breast cancer: the role of transforminggrowth factor beta and CD105［J］. Microse Res Tech, 2001, 52: 437-449

　　［2］Weidner N, Folkmen J, Pozza F, et al. Tumor angiogensis: a new significant and independent prognostic in early-stage breast cacinoma［J］. Natl Cancer Inst, 1992, 84(7): 1875

　　［3］Cheifetz S, Hemandez H, Laiho M, et al. Human cell surface glycoprotein related to cell proliferation is the receptor for transform［J］. Journal of Biology Chemistry, 1990, 265(33): 20533-20538

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　　河北省唐山市，华北煤炭医学院病理学教研室