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关键词 肺虚痰阻；化痰；中药治疗；白细胞粘附分子；大鼠
摘要 目的 探讨化痰方对肺虚痰阻大鼠白细胞粘附分子表达的影响。方法 采用SO2熏吸法建立肺虚痰阻动物模型，应用流式细胞仪检测正常及肺虚痰阻大鼠周围血白细胞CD11a、CD18、CD54、CD62L的表达。结果 化痰方能够明显减轻肺虚痰阻大鼠周围血白细胞CD11a、CD18、CD54、CD62L的表达。结论 化痰方抵制CD11a、CD18、CD54、CD62L的表达在肺虚痰阻治疗中起了重要作用。
本实验通过采用二氧化硫（SO2）熏吸和寒冷刺激建立肺虚痰阻动物模型，观察中药化痰方对实验大鼠白细胞CD11a、CD18、CD54、CD62L表达的影响，初步探讨化痰方作用的分子机制，力求对中药作用的靶点有进一步认识，为痰证治疗提供新的理论依据。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 健康SD大鼠，体重180～200g，24只，清洁级。由同济医科大学实验动物中心提供。
1.1.2 实验药物 化痰方由党参15g，黄芪20g，陈皮10g，法夏10g，茯苓15g，杏仁10g，白芥子15g，制南星6g，炙甘草6g组成。
1.1.3 实验试剂 CD11a、CD18、CD54、CD62L小鼠抗大鼠单克隆抗体（深圳晶美生物工程有限公司）。
1.1.4 实验仪器 美国BECTON DICKINSON公司生产流式细胞仪。
1.2 实验方法
1.2.1 模型制备 将24只大鼠随机分为3组：肺虚痰阻组（模型组）、化痰方（对照组）、生理盐水组（正常组），每组8只。模型置备参照文献方法［1，2］建立，具体如下，除正常对照组外，各组予SO2烟熏（6g硫磺粉洒布于清艾条中点燃）和寒冷刺激，每次烟熏40min后，用低于大鼠生活环境5℃的冷风刺激10min，每天2次。
1.2.2 给药方法 化痰组予中药按9.5g/(kg·d)灌胃，模型组和生理盐水组每天予同体积生理盐水灌胃，连续14d。
1.2.3 一般情况观察 体重，活动状况，毛发，粪尿，咳嗽，气喘及口鼻分泌物等。
1.2.4 病理切片 取实验大鼠气管及左、右肺叶，放入多聚甲醛中固定，切片观察镜下改变。
1.2.5 白细胞粘附分子的检测 取肝素抗凝的大鼠全血80μl到Ep管中，加入CD11a、CD18、CD54、CD62L小鼠抗大鼠单克隆抗体10μl，避光静置15min，加入FITC荧光标记的羊抗小鼠的二抗，混匀，避光静置15min，加入红细胞溶解液450μl，充分混匀，避光静置10min，1 500r/min离心5min，去上清，每管加入0.5ml PBS溶液，300目筛网过滤后上机检测CD11a、CD18、CD54、CD62L阳性表达细胞的比例。
1.3 统计学方法 实验数据应用SPSS13.0统计软件行方差分析q检验,检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况 模型组大鼠普遍出现口鼻分泌物增多、咳嗽、气喘、食少、精神萎靡、少动、拱背蜷睡、毛发零乱、脱落、缺少光泽等表现。正常组大鼠活泼好动，皮毛光泽发亮，食欲旺盛。
2.2 病理组织学所见 模型组大鼠杯状细胞增生，腺体肥大、增生，分泌旺盛，管腔内充满大量中性粒细胞、肺泡巨噬细胞及粘液，纤毛稀少。
2.3 白细胞粘附分子的表达 见表1。
表1 白细胞粘附分子阳性表达比较（略）
如表1所示，肺虚痰阻大鼠粘附分子CD11a、CD18、CD54、CD62L的表达与正常组比较差异有统计学意义（P<0.01）；化痰组CD11a、CD62L表达与模型组差异有统计学意义（P<0.05），CD18、CD54表达与模型组差异有统计学意义（P<0.01）。
3 讨论
3.1 模型评价 二氧化硫是一种有毒的刺激性气体，近年来，通过采用烟熏复制肺气虚模型，已被中医研究者所公认。通过实验发现模型组出现了咳嗽、气急、逆毛、鼻部潮湿、拱背蜷睡，反应迟钝等肺虚的表现。痰液主要是由杯状细胞和腺体分泌的粘液所组成，病理切片发现模型组杯状细胞和腺体增生，说明了痰液生成增加，依中医辨证分析，符合肺虚痰阻病理模型。为验证模型的可靠性，在造模的同时，运用临床经验组方化痰方进行反证，通过对上述指标综合分析，发现化痰方化痰作用明显。通过治疗的反证。使模型的可行性得到进一步验证，同时说明运用传统化痰法治疗相关痰证合理有效。
3.2 从粘附分子表达探讨化痰方作用 细胞粘附分子是一群在多种细胞上表达，介导细胞间粘附和作用的糖蛋白物质，其以受体-配体结合的形式发挥作用，参与细胞的识别与活化、信号转导、细胞的分化与调亡，调节细胞功能，并与许多疾病密切相关［3,4］。特别是在炎症反应过程中其起关键作用 ,参与炎症过程的粘附分子主要有三个家族,为此我们观察了三个家族中有代表性的粘附分子。其中我们研究的CD11a/CD18属整合素家族，它介导白细胞的聚集、趋化与粘附。CD54又名细胞间粘附分子-1(ICAM-1),属免疫球蛋白基因超家族，是整合素家族的配体，通过与其配体淋巴细胞相关抗原-1(LFA-1)结合而促进Ｔ细胞活化及白细胞从血管内向炎症部位浸润，参与炎症和免疫反应，这在维持机体的正常生理功能和疾病的发生发展过程有重要意义。L-选择素属选择素家族，对中性粒细胞和单核细胞在炎症部位的活化和聚集具有重要影响。本研究显示肺虚痰阻大鼠CD11a、CD18、CD54、 CD62L表达均明显升高，显著高于正常对照组(P<0.01)，而治疗后均明显下降，说明了粘附分子协同作用参与痰邪致病，中药对于粘附分子的相互作用有调节作用。目前，中药在治疗肺系疾病中哮喘、慢性支气管炎、支气管扩张症等病的临床效果均非常显著，特别是其化痰作用明显，至于其作用机制目前研究较少，本文从粘附分子的角度初步研究化痰机制，旨在研究化痰法，并为痰证的治疗提供一定的理论依据。
4 参考文献
［1］ 王九林，姜惟，卞慧敏.肺虚痰阻病理模型的研制［J］.中国中医基础医学杂志，1996，4(1):44
［2］ 陈小野.实用中医证候动物模型学［M］.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1993：314
［3］ 周同,李晓,陈金联.细胞粘附分子与缺血再灌注损伤［J］.上海医学,1998,21(11):682
［4］ Frenette PS,Wagner DD.Adhesion molecules-part1［J］.N Engl J Med,1996,334(23):1526
北京市，北京中医药大学中医诊断系
唐山职业技术学院临床医学系
湖北中医学院