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Home医源资料库在线期刊中国煤炭工业医学杂志2006年第9卷第8期

大鼠脑挫裂伤后海马区神经细胞凋亡及血清NGF的变化

来源:中国煤炭工业医学杂志
摘要:关键词细胞凋亡。大鼠摘要目的探讨大鼠脑挫裂伤后海马区神经细胞凋亡及血清神经生长因子(NGF)的变化及意义。方法按照改良Feeney自由落体脑损伤模型方式制作大鼠左顶叶脑挫裂伤模型,应用酶联免疫吸附法和原位细胞凋亡法,分别对脑挫裂伤后0。5,1,3,6,12,24,72,120,168,240h各时相点血清NGF含量及脑组织细胞......

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  关键词  细胞凋亡;脑挫裂伤;神经生长因子;大鼠

  摘要  目的  探讨大鼠脑挫裂伤后海马区神经细胞凋亡及血清神经生长因子(NGF)的变化及意义。方法  按照改良Feeney自由落体脑损伤模型方式制作大鼠左顶叶脑挫裂伤模型,应用酶联免疫吸附法和原位细胞凋亡法,分别对脑挫裂伤后0.5,1,3,6,12,24,72,120,168,240h各时相点血清NGF含量及脑组织细胞凋亡进行检测。结果  大鼠脑挫裂伤后24h海马区神经细胞开始出现凋亡阳性细胞(16.50±2.51),72,120h逐渐增多[分别为(17.83±2.04),(23.67±1.51)],168h达到高峰(27.33±1.86),240h开始下降(21.67±2.07);血清NGF含量于脑挫裂伤后3h开始增高[(6.31±1.93)pg/ml],12h达顶峰[(20.57±12.44)pg/ml],24h开始降低[(6.78±3.62)pg/ml],120h接近正常组水平[(3.25±0.81)pg/ml],168,240h回升[分别为(6.59±3.14)pg/ml、(5.92±3.40)pg/ml]。结论  大鼠脑挫裂伤后海马区神经细胞凋亡与时间有关,血清NGF含量增高对脑创伤后神经细胞有一定的保护作用,适时使用抗凋亡药物可能对减轻脑创伤后神经细胞损伤有益。

  CHANGES OF NEUROCYTES APOPTOSIS AND SERUM NGF LEVEL AFTER CEREBRAL CONTUSIONS IN RATS 

  Zou Jimin,Yuan Baojun,Bai Yunchi,et al.

  The Affiliated Kailuan Hospital of North China Coal Medical College, Tangshan 063000,China

  Key words  apoptosis; cerebral contusion; nerve growth factor

  Abstract  Objective  To investigate the changes and significances of neurocytes apoptosis and serum nerve growth factor(NGF) after cerebral contusions. Methods  The models of rats cerebral contusion were made according to the modified Feeney method,The related parameters in different times after cerebral contusion were detected respectively,in situ cell apoptosis detected by the TUNEL method,and serum NGF by enzyme linked immunosorbent assay. Results  Levels of  NGF  in serum and the apoptosis positive neurons in the hippocampal region increased in different times after cerebral contusion and decreased afterwards. Apoptosis positive neurons cells were found in the hippocampal region 24h after cerebral contusion(16.50±2.51),and got to peak at 168h (27.33±1.86)then decreased at 240h(21.67±2.07).At 12h after cerebral contusion serum NGF were significantly higher than those of control group,and it began to regain at 120h (P>0.05). Conclusion  After cerebral contusion,there might  exist a specific relationship between neuron apoptosis in hippocampal region and time,and the levels of serum NGF increased rapidly,it was indicated that using some medicine to stop  neuron apoptosis in time,might do good to the recover of cerebral contusions.

    脑挫裂伤后神经系统发生一系列继发性损伤,影响患者康复。研究发现,脑挫裂伤后大脑皮质、海马和丘脑等部位均存在细胞凋亡,且细胞凋亡程度与伤后认知缺陷的严重性、癫的发生率有着密切关联。但脑挫裂伤后神经细胞凋亡与致伤时间的关系、影响神经细胞凋亡的因素等尚未完全阐明。我们应用原位末端标记检测法,对大鼠脑挫裂伤模型的不同时相海马区神经细胞的凋亡进行观察,同时检测血清神经生长因子(NGF),探讨脑挫裂伤后颅脑损伤的变化,为临床研究脑损伤机制和治疗脑挫伤提供理论依据。

  1  资料与方法

  1.1  实验动物分组  健康雄性Wistar大鼠126只(河南省实验动物中心提供),体重250~350g,随机分成正常组、对照组、实验组,其中后二组又各自分成0.5,1,3,6,12,24,72,120,168,240h十个时相组,每组6只大鼠。按照改良Feeney[1]自由落体脑损伤模型方式制作大鼠左顶叶脑挫裂伤模型。

  1.2  动物模型制备  以2%戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉大鼠后,切开头皮,分离骨膜,中线旁2mm,冠状缝后开一直径5mm的圆形骨窗,硬膜保持完整。以40g砝码于25cm高处通过一金属导杆落下,撞击置于硬脑膜上的圆锥上致脑挫裂伤,用骨蜡封闭骨窗,缝合头皮,置鼠笼喂养。对照组动物只颅骨开窗,不致伤;正常组动物不做任何处理。各组分别于相应时相点在深度麻醉状态下开胸,穿刺左心室取血,离心分离血清,-20℃保存,同批测定。

  1.3  原位细胞凋亡检测(TUNEL)法  试剂盒由德国宝灵曼公司提供,按照说明书操作,以NBT-BCIP显色;镜下观察,凋亡阳性细胞为新月型或蚕豆状浓染,并可见蓝紫色凋亡小体。

  1.4  计数方法  参照于士柱等[2]提出的计数方法,在装有目镜网格测微尺的400×光镜视野下,随机计数大鼠海马CA2-3区0.01mm2中凋亡阳性细胞数的总数即为其阳性细胞密度。

  1.5  NGF的检测  采用酶联免疫吸附法,试剂由美国LIFEKEY生物医学公司提供,于酶标仪450nm处读取吸光度,按照系列标准浓度与相应吸光度做标准曲线而得样本NGF浓度。

  1.6  统计学方法  实验中所得数据均以±s表示,采用方差分析q检验

  2  结果

  2.1  TUNEL  正常组海马区神经细胞未见凋亡阳性细胞;对照组海马区神经细胞偶见凋亡阳性细胞,因数量极少未能计数;伤后0.5~12h各时相点均未见凋亡阳性细胞,大鼠脑挫裂伤后24h海马区神经细胞已出现凋亡阳性细胞(16.50±2.51),伤后72,120h逐渐增多,分别为(17.83±2.04)、(23.67±1.51),于伤后168h达到高峰(27.33±1.86),到伤后240h开始下降(21.67±2.07)。

  2.2  脑挫裂伤后NGF水平变化  与正常组比较,实验组、对照组NGF水平在脑挫裂伤后3~72h,168h,240h增高,3h开始增高,12h达顶峰,24h开始降低,120h接近正常组水平,168,240h又略增高;实验组与对照组比较,6,12hNGF水平显著增高,差异有统计学意义,结果见表1。

  表1  三组大鼠脑挫裂伤后不同时相血清神经生长因子水平比较(略)

  3  讨论

  脑挫裂伤后多种因素参与了继发性脑损伤的病理过程。本实验应用原位末端标记法观察实验组海马神经细胞凋亡的情况。发现大鼠脑挫裂伤后24h海马区神经细胞开始出现凋亡阳性细胞,72h、120h逐渐增多,168h达到高峰,240h开始下降。表明大鼠脑挫裂伤后海马区神经细胞凋亡与时间有关。其凋亡机制可能为:脑挫裂伤后,钙离子依赖的核酸内切酶被激活,作用于DNA序列,造成凋亡细胞特异的凋亡小体的出现;同时,细胞外Ca2+内流,刺激突触前终板释放过量兴奋性氨基酸,进一步破坏细胞膜通透性,加剧Ca2+内流,导致神经细胞凋亡的启动。NGF是神经系统最重要的生物活性分子之一,也是最早发现的神经营养因子,兼有神经元营养和促突起生长双重作用。本研究正常组大鼠血清NGF含量甚微,但在维持和促进神经细胞的存活、分化和成熟以及执行功能中起重要作用[3];脑挫裂伤后3h大鼠血清NGF开始增高,12h达顶峰,24h开始降低,120h恢复正常水平,但168h、240h回升,提示NGF参与了脑损害与恢复的全过程,尤其在早期急性期起重要的调节作用[4],表明NGF可能参与损伤神经的再修复,延缓神经元坏死和凋亡,刺激轴突芽生和突触形成,促进内皮细胞分裂和分化,刺激神经血管的生成,最终实现神经生理功能的重构。但脑损伤后NGF上调的机制尚不清楚,有学者认为,脑损伤后谷氨酸的产生和Ca2+内流可引起NGF生成增加[5];也有报道认为,脑损伤诱导脑内星形胶质细胞和小胶质细胞激活,增殖并产生大量白介素-1β,由此在脑内直接诱导NGF的上调[6];NGF增加也可能是机体对损伤的应激反应所致。此外,我们发现,脑挫裂伤后24h时血清NGF浓度开始下降之时,恰为海马区神经细胞出现凋亡之始。提示内源性NGF的产生浓度低,维持时间短,尚不足以抵抗兴奋性氨基酸毒性、Ca2+内流及自由基等因素的损伤神经作用。如能适时采用外源性NGF或其他抗凋亡药物阻断继发性颅脑损伤后的细胞凋亡等病理改变,有望改善脑损伤患者预后,提高生存质量,减少伤残率,降低病死率。

  4  参考文献
 
  [1]  Feeney DM,Boveson MG,Linn RT,et al.Responses to cortical injury:I.Mothodology and local effects of contusions in the rat[J].Brain Res,1981,211(1):67-77
 
  [2]  于士柱,浦佩玉,江德华,等.胶质瘤Bcl-2基因表达水平与其细胞增殖和凋亡关系的研究[J].中华病理学杂志,2000,29 (1):12-15
 
  [3]  Varon S,Conner JM.Nerve growth factor in CNS repair[J].J Neurotrauma,1994,11(5):473-486
 
  [4]  Ballarin M,Ernfors P,Lindefore N.Hippocampal damage and kain acid injection induce a rapid increase  in mRNA for BDN F and NGF the rat brain[J].Exp Neurol,1991,114(1):35-43
 
  [5]  彭瑞云,高亚兵,肖兴义,等.bFGF和NGF基因在大鼠脑震荡脑损伤中的表达研究[J].中国危重病急救医学,2003,15(4):213-216
 
  [6]  Dekosky ST,Styren SD,OˊMalley ME,et al.Interleukin-1 receptor antagonist suppresses neurotrophin in injury rat brain[J].Ann Neurol,1996,39(1):123-127

  河北省唐山市,华北煤炭医学院附属开滦医院 

  华北煤炭医学院附属医院

作者: 邹吉敏 袁宝军 白云驰 阚志生 丁焕然 2007-4-26
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