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关键词 肺腺癌；羟基喜树碱；足叶乙甙；放射增敏；联合用药
放化疗是恶性肿瘤治疗的重要措施，如何提高治疗疗效是近年来研究的热点。实验表明，拓朴异构酶（TOPO）Ⅰ与TOPOⅡ抑制剂联合使用的抗癌效果高于单药，但依赖于给药的先后顺序与给药间隔。同时给药有拮抗作用，序贯给药有协同作用。目前国外对TOPOⅠ与TOPOⅡ抑制剂联合用药时的给药顺序、时间间隔的报告不一，国内尚未见报道。本研究旨在探讨TOPOⅠ抑制剂（羟基喜树碱，HCPT）与TOPOⅡ抑制剂（足叶乙甙，VP-16）联合应用时抗癌效应与时间、顺序依赖性的关系及放射增敏的作用，现将实验结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 细胞株 人肺腺癌GLC-82细胞株：中国医学科学院肿瘤研究所提供。用RP-MI-1640（含10%小牛血清）培养基、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养,常规传代。
1.2 药物及配制 HCPT 5mg/支、VP-16 100mg/支。参考药物血浆峰浓度(PSC)，其中HCPT为2μg/ml、VP-16为5μg/ml，用生理盐水配制后进行实验干预。
1.3 四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定药物对肿瘤细胞的增殖抑制作用 数生长细胞, 各组细胞以1×104/ml，200μl/孔接种于96孔细胞培养板，在37℃，5%CO2条件下培养24h后，分为3个实验组。实验组1：单纯加入HCPT20μl。实验组2：单纯加入VP-16 20μl。实验组3：每孔加入HCPT20μl，并于0，12，24h后加入VP-16 20μl。对照组加入20μl PBS缓冲液，每一药物浓度设3个复孔，各组细胞于37℃、5%CO2、饱和湿度培养48h后终止培养，每孔加入MTT应用液20μl，37℃继续培养4h，小心吸弃孔内培养液上清液。每孔加入DMSO液150μl，微量震动摇床震动摇匀10min，选择490nm波长，在酶标仪上检测各孔OD值，依据公式抑制率（CI）=（1-实验组OD/ 对照组OD）×100%计算化疗药物对各孔细胞的抑制率。实验重复3次。
1.4 HCPT联合VP-16对肺腺癌放射增敏作用的研究 为4个实验组。实验组1：单纯放疗组。实验组2：放疗+HCPT。实验组3：放疗+VP-16。实验组4：放疗+HCPT+VP-16，VP-16于HCPT后12h加入。加药均在放射治疗后进行，剂量同1.3述。对照组不接受射线照射，每一照射剂量设3个复孔。各实验组源皮距均为100cm，培养板表面覆盖0.5cm体膜，在剂量率2.0Gy/min分别接受1Gy、2Gy和4Gy剂量6mV-X线照射。各组细胞于37℃、5%CO2、饱和湿度培养6d后终止培养，每孔加入MTT应用液20μl，37℃继续培养4h，小心吸弃孔内培养液上清液。每孔加入DMSO液150μl，微量震动摇床震动摇匀10min，选择490nm波长，在酶标仪上检测各孔OD值，依据公式细胞存活率 = 实验组OD/对照组OD计算各孔细胞存活率。
1.5 统计学方法 数据采用SPSS10.0统计软件进行分析。
2 结果
2.1 HCPT、VP-16单药及联合用药对肺腺癌GLC-82细胞生长的抑制作用 HCPT及VP-16对GLC-82细胞均有较强的细胞毒作用，HCPT单药对GLC-82细胞生长的抑制率为27.92%，虽然高于同时给药组(25.46%)，但二组相比差异无统计学意义(P>0.05)，而先给HCPT 12h后给VP-16组对细胞生长抑制率为38.31%，明显高于同时给药组，二者差异有统计学意义(P<0.05)。尽管先给HCPT 12h后给VP-16组抑制率高于间隔24h组，但差异无统计学意义(P>0.05)。
表1 HCPT、VP-16及二者联合对肺腺癌GLC-82细胞生长抑制作用（略）
2.2 HCPT联合VP-16对肺腺癌细胞GLC-82放射增敏作用 表2显示放疗+HCPT组、放疗+VP-16组及放疗+HCPT+VP-16组存活率明显低于单纯放疗组，差异有统计学意义(P<0.05)。其中放疗+HCPT+VP-16组存活率最低，与放疗+HCPT组及放疗+VP-16组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。
表2 GLC-82细胞在不同实验组中存活率（略）
3 讨论
由于抑制功能的互补性，TOPOⅠ抑制剂与TOPOⅡ抑制剂联合应用是可取的方案。许多报道表明，TOPOⅠ与TOPOⅡ抑制剂无交叉抗药性［1］。Bonner等［2］以非小细胞性肺癌细胞株V79在等毒性剂量下，拓扑替康（TPT）：VP-16按1∶3.2剂量比例先给TPT后给VP-16，细胞毒性显著高于先给VP-16，后给TPT，发现二者具有顺序依赖性的协同作用。在体外试验中，CPT与VP-16同时合用于人结肠癌HT-29细胞时，可观察到有拮抗作用；而当按时间顺序给药时，CPT与VP-16联合用药，不仅无拮抗作用，如果使二药间隔6h或更长，还可使细胞毒作用出现相加效应［3］。本研究所得结果与既往研究相似，先给HCPT 12h后给VP-16组对GLC-82细胞生长抑制率达38.31%，明显高于其他组。放射治疗中应用TOPO抑制剂，一是使细胞存活曲线的D0值降低，直接增加细胞对放射线的敏感性；二是抑制细胞对放射线所致的潜在致死损伤的修复和亚致死损伤的修复。文献报道［4］，应用不同的细胞系和不同的TOPO抑制剂，当与放射同时应用时，均显示有放射增敏作用。本研究表明在放射治疗中按时间顺序给予HCPT与VP-16，能明显增加对放疗的敏感性，降低GLC-82细胞存活率。总之，通过本研究分析了TOPOⅠ抑制剂HCPT与TOPOⅡ抑制剂VP-16联合应用时给药的先后顺序及间隔时间，且探讨了HCPT与VP-16联合用药时对放疗增敏的作用，为明确TOPOⅠ与TOPOⅡ抑制剂联合用药的给药顺序、间隔时间提供了客观依据，并为临床上提高放疗疗效提供了实验依据。
4 参考文献
［1］ Pavillard V,Kherfellah D,Richard S,et al.Effects of the combination of camptothecin and doxorubicin or etoposide on rat glioma cells and camptothecin-resistant variants［J］.Br J Cancer,2001,85(7):1077-1083
［2］ Bonner JA,Kozelsky TF.The significance of the sequence of administration of topotecan and etoposide［J］.Cancer Chemother Pharmacol,1996,39(1-2):109-112
［3］ Bertrand R,Conner PM,Kerrigan D,et al.Sequential administration of camptothecin and etoposide circumvements the antagonistic cytotoxicity of simulataneous drug administration in slowly growing human colon carcinoma HT-29 cells［J］.Eur J Cancer,1992,28A(4-5):743-748
［4］ 王绿化，杨伟志.羟基喜树碱放射增敏作用的离体研究［J］.中华肿瘤杂志,2000,22（2）:124-126
066000 河北省秦皇岛市第一医院肿瘤科