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【摘要】 目的 制备人原发性胆囊癌单克隆抗体，对其特异性进行研究。方法 以胆囊癌细胞系SGC-996免疫Balb/c小鼠，应用淋巴细胞杂交瘤技术，获得稳定分泌抗SGC-996单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞。结果 杂交瘤细胞符合融合细胞核型特点，有较强的成瘤性。抗体亚类为IgG1。相对应的抗原主要表达在胞质和胞核中，分子量约为67kD。抗体对胆囊癌有较强的免疫反应，其他癌组织、癌旁组织及间质、正常胆囊上皮和成纤维细胞均呈阴性。结论 建立一株杂交瘤细胞系，能稳定分泌单克隆抗体，该抗体具有较高特异性。
【关键词】 胆囊癌；杂交瘤；单克隆抗体；免疫组织化学/免疫细胞化学
Preparation and Characterization of Monoclonal Antibody Against Human Idiopathic Gallbladder Carcinoma
HE Lang1，WANG Dan1，YANG Yao-qin2
(1.Department of Biochemistry，Chengdu Medical College，Chengdu 610083 China；2.Tumor Research Center of Tongji University，Shanghai 200091 China)
Abstract：Objective To prepare monoclonal antibody(McAb)against human gallbladder carcinoma antigen and to lay a foundation for further study of the tumour,clinical diagnosis and drug-guided treatment.Methods Balb/c mice were immunized with SGC-996 human gallbladder carcinoma cells.The lymphocytes hybridoma technique was used for McAb preparation.The character of McAb associated antigen was tested through the immunohistochemistry(IHC),immunocytochemistry（ICC）and Western blott.Results The analysis of chromosome showed that the hybridoma cells had the characterization of both SP2/0 and mice spleen cell.The cell line inoculated in abdominal cavities of Balb/c could develop to tumour on mesentery.The McAb was found to be the IgG1 isotype.The antigen recognized by McAb was a protein with a molecular weight of 67kD and located in cytoplasm and karyon of SGC-996.The ICC results showed that the McAb 4E6 reacted strongly to gallbladder carcinoma and negative to gastric carcinoma，colorectal carcinoma，hepatocellular carcinoma,esophageal carcinoma and non-digestive tract tumor.Conclusion The hybridoma cell line can be prepared to secrete stably monoclonal antibody against human gallbladder carcinoma.It could react specificially with gallladder carcinoma.
Key words：Human gallbladder Carcinoma;Hybridoma;Monoclonal Antibody;Immunohistochemistry;Immunocytochemistry
原发性胆囊癌(primary carcinoma of the gallbladder，PCG)是胆道系统常见的恶性肿瘤，早期无特殊症状，给胆囊癌的诊断，尤其是早期诊断，带来很大困难。寻找原发性胆囊癌特异性肿瘤标志物，为胆囊癌的早期诊断及预后提供可靠、准确的判断指标，已成为研究原发性胆囊癌生物学行为的重要环节。本研究以人原发性胆囊腺癌细胞株为免疫原，制备该细胞株单克隆抗体，并对其特异性进行了研究。
1 材料与方法
1.1 实验动物
Balb/c小鼠，雌性，9～12周龄，购自第二军医大学实验动物中心。
1.2 组织与细胞株
胆囊癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌、肺成纤维细胞，由同济大学肿瘤研究中心提供；SP2/0骨髓瘤细胞，购自中科院上海细胞所。病理组织切片取自同济大学附属同济医院。
1.3 主要试剂
PEG1500、HAT、HT购自SIGMA公司；SABC免疫组化试剂盒购自华美公司；小鼠单抗免疫球蛋白亚型鉴定试剂盒购自晶美公司。
1.4 方法成
1.4.1 单克隆抗体制备
采用9～12周龄雌性Balb／c小鼠，以5×105 SGC-996胆囊癌细胞免疫3次，每次间隔2周，前两次为腹腔注射，末次为尾静脉注射［1］。末次免疫后3天取脾细胞；与小鼠骨髓瘤细胞SP2／0以5∶1比例在50％PEG1500作用下进行融合。用含HAT的DMEM培养液在96孔板中选择培养，当杂交瘤细胞长满孔底2/3，取上清液用ABS-ELISA法进行克隆筛选，选择对SGC-996细胞呈强阳性反应的克隆，扩大培养于含20％小牛血清的DMEM培养基和5％CO2的孵箱中，部分冻存［2］。1×105杂交瘤细胞接种于注射过石蜡的Balb／c小鼠腹腔中，7天后获得富含单抗的腹水。
1.4.2 单克隆抗体鉴定
杂交瘤细胞核型分析、腹水型McAb效价测定按文献报道［3，4］的方法进行。McAb免疫球蛋白类型及亚类鉴定参照试剂盒说明书操作。
1.4.3 免疫细胞化学和免疫组织化学染色
参照常规SABC法进行。切片抗原修复，放于0.01M枸橼酸钠缓冲液中，煮沸10min。本实验共检测细胞株7种，肿瘤组织切片47例。
1.4.4 单抗识别抗原的提取和分析
以膀胱癌细胞为对照，取对数生长期SGC-996细胞及EJ膀胱癌细胞，用PBS冲洗细胞后，加入细胞裂解液，置冰上放置20min后，用刮匙将细胞从瓶壁上刮下；在4℃条件下，10 000r离心20min；取含蛋白质的上清液，常规方法行SDS-PAGE和Westem-blot，二抗为碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG（1∶500），BCIP/NBT显色。
2 结果
2.1 杂交瘤细胞株建立
融合细胞生长情况良好（图1），采用ABS-ELISA法筛选，选取OD值较高而细胞数量较少的孔进行亚克隆，经4次亚克隆筛选抗体阳性率逐次图1 融合后7天杂交瘤细胞 ×400
Fig.1 hybridoma cells ×400(seven days after combination)提高，达100％。选一株持续分泌单抗并且滴度最高的杂交瘤，命名为4E6。核型分析显示（图2），
图2 杂交瘤细胞染色体 ×400
Fig.2 The Chromosomal morphology of hybridoma cell ×400杂交瘤细胞核内既有中间着丝、亚中部着丝点等骨髓瘤细胞染色体标记，又有小鼠脾细胞顶端着丝点染色体标记，染色体数目达100条以上，符合小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞的核型特点。杂交瘤细胞接种小鼠腹腔一周后，肠系膜上密布粟粒大小的肿瘤，有较强的成瘤性，(图3)。冻
图3 杂交瘤细胞成瘤性
Fig.3 tumorigenicity of hybridoma cell line存半年后复苏的杂交瘤细胞，仍能分泌抗体，具有较高的活性。
2.2 单克隆抗体的生物学特性
小鼠单抗免疫球蛋白亚型鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体亚型为IgG1，轻链类型为κ链（图4）。ABS
图4 抗体免疫球蛋白亚型
Fig.4 Isotype of the McAb 4E6
-ELISA法测定培养上清液及腹水的效价均大于1∶128 000，效价较高。免疫组织化学、免疫细胞化学及Westem-blotting发现（图7）该抗体对应抗原蛋白在胞质和胞核中均有表达，分子量约为67kD。
2.3 单克隆抗体与肿瘤组织的反应性
细胞系免疫细胞化学的半定量测定（图5A,B），结果见表1。胆囊癌免疫组织化学染色（图6）及各类癌组织免疫组织化学染色的半定量检测见表2。表1 免疫细胞化学的半定量结果表2 免疫组织化学染色结果
3 讨论
本研究以人胆囊癌细胞为免疫原，用淋巴细胞杂交瘤技术获得了一株能持续稳定分泌抗人胆囊癌单抗的杂交瘤细胞，命名为4E6。阳性克隆筛选中，普通ELISA检测的灵敏度多数报道为20ng/ml～100ng/ml，且间接法ELISA抗原包被浓度需达到1μg／ml～10μg／ml［5］。我们用胆囊癌细胞SGC-996包被96孔板作为抗原对抗体进行检测，并依据文献［6］进行实验方法改进，采用ABS-ELISA法，取得了较好结果。
免疫细胞化学染色结果显示，SGC-996、GBC-SD胆囊癌细胞均呈强阳性反应，而胃癌细胞BGC-803、BGC-823，MCF-7乳腺癌细胞、EJ膀胱癌细胞和WI38人肺成纤维细胞则均为阴性反应。免疫组织化学染色结果，胆囊癌均呈强阳性反应；食管癌、胃癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌等癌组织和正常胆囊上皮，癌旁组织及间质均为阴性。这些结果说明，该单克隆抗体对胆囊癌有高度特异性，而正常组织则阴性反应，提示其识别的抗原极有可能是一种肿瘤标志物。另外，Western-blot实验中，将膀胱癌作为对照，抽提了胆囊癌和膀胱癌细胞总蛋白，杂交的结果显示，4E6单抗所针对的抗原在胆囊癌中有较高的表达，而在膀胱癌中无表达。进一步验证了免疫细胞化学的结果。
4E6单抗显示出了较高的胆囊癌特异性，有望用于胆囊癌及消化道肿瘤的免疫诊断及相关研究。然而，由于目前检测的病例数尚有限，肿瘤类型也不够齐全，该单抗的组织特异性还需要通过积累更多的病理材料才能作出更全面、准确的结论。
【参考文献】
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