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【摘要】 目的 制备一种可溶性固定化木瓜蛋白酶并对其部分酶学性质进行研究。方法 将木瓜蛋白酶偶联在亲水性高分子聚合物羧甲基纤维素醋酸琥珀酸酯（AS-L）上制备得到水溶性固定化木瓜蛋白酶。在相同的条件下测定游离的木瓜蛋白酶和水溶性固定化木瓜蛋白酶的活力，得到两种状态的酶的最适作用pH值和最适作用温度，再于它们各自的最适条件下测定活力，得到各自的Km值；在相同的条件下测定两种状态的酶的热稳定性、酸碱稳定性、低温稳定性和回收稳定性。结果 游离木瓜蛋白酶和可溶性固定化木瓜蛋白酶的最适作用pH值分别为6.0和5.0，最适作用温度分别为60℃和70℃，Km值分别为2.53、3.07mg·ml-1；可溶性固定化木瓜蛋白酶在60℃条件下，保温12h，仍有62%的活性；在4℃条件下，30d后活性保留达90%以上；在pH6.0时稳定性最好，在pH4.0～7.0范围内也比较稳定（相对活性＞80%）。结论 可溶性固定化木瓜蛋白酶能够在pH5.5以上的溶液中完全溶解，最适作用pH值范围变窄，最适作用温度和Km值升高；热稳定性和酸碱稳定性均明显增强。
【关键词】 可溶性固定化酶；木瓜蛋白酶；酶学性质
Preparation and Properties of Soluble Immobilized Papain
LIU Huan1,LIN Ling２,WANG Yu-ming１,HE Lang１
(Chengdu Medical College,1.Department of Biochemistry,2.School of Clinical Medicine;Chengdu 610083,China)
Abstract：Objective To prepare a soluble immobilized papain and determine its enzymatic properties.Methods The soluble immobilized papain was obtained by conjugating the papain with the hydrophilic high molecular polymer carboxylmethylcellulose acetic succinate.Under the same condition,the activities of immobilized and soluble papains were determined to conclude their optimum pH and temperature,then under these respective optimum conditions,their activities were determined to conclude their Km value.At the same time,the thermodynamic stability,the acid-base stability,the low temperature stability and the operational stability were respectively detected.Results The optimun pH values of soluble and immobilized papain were 6.0 and 5.0.Their optimum temperature were 60℃ and 70℃.Their Km values were 2.53 and 3.07mg·ml-1.Under 60℃,after 12 hours the relative activity of immobilized papain was 62%.Under 4℃,after 30 days the relative activity was still over 90%.Under the pH 6.0,after 72 hours the activity of immobilized papain didn't decrease,and betweeen pH 4.0 and 7.0 its stability was high(relative activity was over 80%).Conclusion Soluble immobilized papain can fully solubilize above the pH 5.5.The optimum pH range of papain was narrow,and its optimum temperature and Km value were all higher than before.Its thermodynamtic stability and the acid-base stability were also strengthened.
Key words：Soluble immobilized enzyme;papain;enzymatic property
木瓜蛋白酶［EC3.4.22.2］是一种重要的生化试剂。木瓜蛋白酶具有稳定性好、水解催化活性高等特点，使其在食品、医药、纺织等工业生产中有着广泛的用途。近年来关于固定化木瓜蛋白酶的报道较多，但是研究主要集中在制备不溶性的固定化酶［1,2,3］。传统方法制备得到的不溶性固定化酶具有稳定性好和回收方便等优点，但是在面对难溶性底物和高粘度底物溶液时，应用却大大受限，催化效率低下。为此，本文将木瓜蛋白酶通过共价键固定在亲水性高分子载体AS－L上，制备得到了可以溶解于反应体系的可溶性固定化木瓜蛋白酶，通过游离酶和固定化酶若干性质的比较，为可溶性固定化木瓜蛋白酶在医药生产中的应用建立了技术基础。
1 材料与方法成
1.1 材料
木瓜蛋白酶（Sigama公司），羧甲基纤维素醋酸琥珀酸酯（AS-L，日本信越株式会社），1－乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺（EDC，上海东风生物技术有限公司），牛血清白蛋白（成都科龙化工试剂厂），考马氏亮兰G250（上海东风生化试剂公司），壳聚糖（上海伯奥生物科技有限公司，脱乙酰度≥90％）。其余试剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 蛋白质含量测定 参考文献方法［4］，采用Bradford法。
1.2.2 木瓜蛋白酶活力测定 参考文献方法［5］，1个酶活力单位（U）定义为40℃时，单位时间内水解1mg牛血清白蛋白所需要的酶量。
1.2.3 可溶性固定化酶（SIP）的制备 参考文献方法［6］，在磁力搅拌下向20ml木瓜蛋白酶溶液（500μg/ml,pH6.0～6.5）中滴加入一定量的10％EDC溶液和AS-L溶液，10℃～15℃温度下反应一段时间后，调节溶液pH4.0左右，离心收集沉淀，用柠檬酸钠缓冲液（0.02M，pH4.0）洗涤后，离心收集沉淀。沉淀溶于PBS缓冲液（0.02M，pH6.0），定容至100ml即得SIP溶液。
1.2.4 可溶性固定化木瓜蛋白酶（SIP）的酸碱溶解性 调节SIP溶液pH，3000rpm离心后收集上清液，测定其溶液280nm处吸光度值，计算其相对溶解度。
1.2.5 可溶性固定化木瓜蛋白酶（SIP）的催化特性1.2.5.1 最适作用pH值 分别取一定量游离木瓜蛋白酶溶液（100μg/ml，pH6.0）和SIP溶液，加入到5.0ml pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0等6种不同pH的缓冲溶液（0.2M）中，40℃测定其活力，计算游离木瓜蛋白酶和SIP在各种pH条件下的相对活力。
1.2.5.2 最适作用温度 分别取一定量上述两种酶液，在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃温度下，测定其活力，计算两者在各个温度下的相对活力。
1.2.5.3 Km值 取上述两种酶液，在最适反应条件下，测定不同浓度的酶活力，可溶性胰蛋白酶的测定条件相同，作双倒数图，计算Km值。
1.2.6 可溶性固定化木瓜蛋白酶（SIP）的稳定性
1.2.6.1 热稳定性 取上述两种酶液，在PBS缓冲液中，60℃下分别保温1h、2h、4h、6h、8h、12h、，测定各个时间段的酶活性，以0h的酶活性为100%，计算各个时间段的相对活性。
1.2.6.2 酸碱稳定性 称取一定量木瓜蛋白酶和SIP，置于不同的pH的缓冲液（4.0～9.0）中，4℃下保存72h，测定各个pH下的酶活性，以保存前pH6.0酶溶液的酶活性为100%，计算各个pH下酶的相对活性。
1.2.6.3 低温稳定性 将上述SIP酶液置于4℃的冰箱中储存，分别于0d、5d、15d、20d、25d、30d测定其活性，以0d的酶活性为100%，计算不同时间的相对酶活性。
1.2.6.4 操作稳定性 将SIP溶液按1.4进行10次沉淀、溶解的回收操作，测定每次SIP溶解后的溶液总酶活力。分别以固定化操作前总酶活力为100％，计算每次的酶活力回收率。
2 结果
2.1 可溶性固定化木瓜蛋白酶（SIP）的酸碱溶解性 如图1，结果表明SIP在pH5.0以上能够完全溶解，在pH4.0左右基本不能溶解。利用此性质，可以使SIP在最适反应pH条件下处于溶解状态，使整个反应体系为均相，能够大大提高催化反应效率。同时利用调节pH的方式能够方便的对其进行回收。
2.2 可溶性固定化木瓜蛋白酶（SIP）的催化特性
2.2.1 最适作用pH值 结果见图2，游离木瓜蛋白酶的最适作用pH为6.0，而可溶性固定化木瓜蛋白酶则是pH5.0。且从图上可以看出，pH偏酸时，可溶性固定化酶的活力明显要高于游离酶。这主要是因为木瓜蛋白酶受到固定化载体AS－L上大量负电荷的影响，使得酶反应的表现pH向酸性方向移动，使得可溶性固定化木瓜蛋白酶在低pH下表现出较强的催化活性。
2.2.2 最适作用温度 结果见图3，游离木瓜蛋白酶的最适作用温度为60℃，而可溶性固定化木瓜蛋白酶则是70℃。且从图上可以看出，温度超过最适作用温度时，可溶性固定化木瓜蛋白酶活力降低速度明显要低于游离酶，这主要是大分子载体的保护作用。
2.2.3 Km值 结果见图4，可溶性固定化木瓜蛋白酶的Km值为3.07mg/ml，而游离酶则为2.53mg/ml。两者很接近，显示可溶性固定化木瓜蛋白酶的催化作用较难溶性固定化酶更加接近游离酶。
2.3 可溶性固定化木瓜蛋白酶（SIP）的稳定性
2.3.1 热稳定性 结果见图5，可知可溶性固定化木瓜蛋白酶的热稳定性要优于游离酶，60℃保温12h后仍然有62％的活性。
2.3.2 酸碱稳定性 结果见图6，可知可溶性固定化木瓜蛋白酶的酸碱稳定性优于游离酶。它与传统难溶性固定化酶的不同在于，两者变化曲线类似，均在pH6.0处最为稳定，这可能是因为两者溶解于缓冲液中，酶分子能够充分接触缓冲液使得两者的变化曲线类似，但是由于载体大分子的保护作用，可溶性固定化木瓜蛋白酶对pH变化的适应性较强，在pH4.0～7.0范围内较为稳定。
2.3.3 低温稳定性 结果见图7，可溶性固定化木瓜蛋白酶有较好的低温稳定性。30d活性保留95％。
2.3.4 回收稳定性 结果见图8，可溶性固定化木瓜蛋白酶有着较好的操作稳定性。在制备后第1次回收（即第2次离心－溶解）时，活力会显著下降，这可能是因为一些游离酶没有通过共价键与载体相连，而是吸附或者包裹在载体中了，沉淀－溶解操作时脱离载体进入上清液的原因。
3 讨论
在反应中使用游离酶导致产品易污染且酶难以重复使用，因而发展了固定化酶技术。传统的固定化酶是将游离酶通过物理或化学方法固定在难溶性载体上制得。这种固定化酶几乎不溶于反应体系，在工业上，能实现酶的反复利用和酶、原料、产物三者间的有效分离，从而简化分离工艺及设备，缩短生产周期，降低生产成本。但是同时由于其不溶于反应体系，使得酶催化反应仅限于固定化酶与底物溶液的接触面上，形成非均相反应，导致固定化酶的催化效率远远低于游离酶。现在有报道提出了柔性固定化酶和定向固定化的概念［3,7］，能够提高难溶性固定化酶制备时的活力回收和催化活性，但是面对难溶性底物或者底物溶液粘度等情况时，难溶性的固定化酶应用依然受到极大限制。
在催化效率方面，本研究制备得到的可溶性固定化酶接近于游离酶。因其能够在反应体系最适pH下处于溶解状态，使得整个反应体系处于均相体系，酶与底物接触几率较固液两相反应体系大大提高。同时由于处于液体溶解状态，载体上的酶可以自由旋转，活性中心能够充分暴露，也增加了酶的催化效率。因此，可溶性固定化酶的催化效率优于传统的难溶性固定化酶。
在稳定性方面，本研究制备得到的可溶性固定化酶接近于难溶性固定化酶。因为酶与大分子载体相连后，处于大分子载体的屏蔽保护下，其稳定性较游离酶仍然大大提高了。在回收操作方面，可溶性固定化木瓜蛋白酶能够通过调节溶液pH而回收，一般的水解产物小分子不会因此沉淀，因此其回收操作也较为方便。
总的来说，可溶性固定化木瓜蛋白酶兼具游离木瓜蛋白酶高催化活性和难溶性固定化酶高稳定及便于回收的特点，在工业应用上有着广阔的前景。
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