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【摘要】 目的 检测大鼠组织中胰腺Ⅱ型弹性蛋白酶mRNA的表达。方法 根据大鼠胰腺Ⅱ型弹性蛋白酶基因序列合成两端含有相邻胸腺嘧啶结构的单链DNA探针，完成杂交后利用抗胸腺嘧啶二聚体抗体与抗原化的单链DNA探针进行反应，再运用免疫组织化学方法从而检出组织中目标mRNA的表达。结果 大鼠胰腺组织的外分泌腺细胞的细胞质被特异性染色，其他的组织细胞均显示阴性。结论 本试验中采用的原位杂交方法操作简便安全、无放射性，并且具有很高的灵敏度和特异性。实验结果提示大鼠胰腺外分泌腺细胞特异性表达胰腺Ⅱ型弹性蛋白酶mRNA，而其他组织细胞不表达。
【关键词】 胸腺嘧啶二聚体；原位杂交；非放射性；弹性蛋白酶；mRNA
A Convenient Non-radio ISH Method for Detection of Pancreatic Elastase Ⅱ mRNA
LＩ De－min
(Department of TCM，The First Affiliated Hospital, Chengdu Medical College，Chengdu 610500，China)
Abstract：Objective To detect the rat pancreatic elastase II mRNA in rats.Methods ISH was preformed by using Oligo-DNA probe based on the sequence of rat pancreatic elastase II mRNA,which 3' and 5' terminal conjugated with -A-T-T structure.The anti-T-T IgG antibody was used to react with haptenized Oligo-DNA in immunohistochemical process.Results Acinar cells in rat pancreas were highly labeled specifically by the probe.Conclusion It was a simple and safety ISH method with high sensitivity and specificity.The acinar cells in rat pancreas expressed pancreatic elastase Ⅱ mRNA specifically.
Key words:Thymine-Thymine dimer；ISH；non-radio；elastase；mRNA
常常用的检测细胞基因表达的技术，已经发展出了很多方法，其中由小路武彦等学者利用胸腺嘧啶二聚体（thymine-thymine dimer，T-T dimer）特性近年来发展出一种无放射性原位杂交方法［1］，在此采用这种方法检测对大鼠组织中胰腺Ⅱ型弹性蛋白酶mRNA［2］的表达进行检测。
1 原理
在生物细胞中有许多含有相邻胸腺嘧啶（thymine）序列的基因片段，当受到紫外线（包括阳光）照射时，任何两个相邻的胸腺嘧啶之间会形成共价键结构（即胸腺嘧啶二聚体），从而造成DNA片段的损伤。但由于T-T dimer具有半抗原的特性，所以可以利用这个特性而应用于ISH。当我们需要检测组织细胞中任何一段mRNA的表达时，可以设计并合成一段单链DNA引物（注意避免其中含有T-T构造），并在目标cDNA的两端链接上含有T-T构造的序列作为单链DNA探针。进行ISH时，用适当剂量的紫外光照射，使探针两端形成T-T dimer，将探针与mRNA杂交后，再使用抗T-T dimer的抗体与探针进行反应，那么运用简单的免疫组织化学技术即可检出组织细胞中目标mRNA的表达。
2 方法
2.1 DNA探针的制备
合成的大鼠胰腺型弹性蛋白酶Ⅱ型的单链DNA片段序列为：tta-gtgccataacactcgaaaccgaggtgagacccga-att，序列为721～754（不包含3和5末端的-A-T-T序列）［2］。在ISH前用254 nm紫外线照射，能量为10kJ/m2。
2.2 组织标本准备
在ISH中，组织标本的制作非常关键。用清洁磷酸缓冲液（PBS，pH7.4）配制的4%多聚甲醛对Wistar大鼠进行灌流固定过夜后，用PBS和含有30% (w/v)蔗糖和0.02% (v/v) DEPC的PBS冲洗并保存于4℃，组织取材后包埋于OCT中以制作冰冻切片。也可采用清洁酒精系列脱水后包埋于石蜡中以制作石蜡切片。大鼠胰腺组织作为阴性对照。
2.3 原位杂交操作
2.3.1 切出5～6 μm厚冰冻切片至于有涂层的清洁玻片上，迅速风干后置于40～45℃烘箱中2 h（如果使用石蜡切片则采用脱蜡程序）。
2.3.2 用PBS洗3次，每次5 min；
2.3.3 0.2 mol/L HCl处理20 min后用去离子水和PBS清洗；
2.3.4 用蛋白酶K（proteinase K ，1 μg/ml)在37°C条件下处理10 min，再用PBS洗净；
2.3.5 用4%多聚甲醛再次固定5 min，再用含有2 mg/ml甘氨酸（glycine）的PBS 溶液洗两次，每次15 min，PBS洗净；
2.3.6 将标本放入40%去离子化的甲酰胺（formamide）/4xSSC 溶液中直到用于杂交；
2.3.7 在标本上滴下20～30 μl的杂交反应液并保持在湿盒中15～17h，温度为 37℃。杂交反应液组成为：10 mmol/L Tris/HCl buffer(pH 7.3),0.6 mol/L NaCl,1mM EDTA,1xDenhardt's solution,250 μg/ml yeast tRNA,125 μg/ml salmon sperm DNA,10% dextran sulfate,40% deionized formamide,1～5 μg/ml T-T-dimerized DNA probe。杂交反应液中不加入DNA探针则作为阴性对照。
2.3.8 反应结束后用50% formamide/2xSSC洗5次，每次15 min。
2.4 免疫组化操作
采用鼠抗T-T IgG单克隆抗体作为一抗，HRP标记的二抗进行反应，通过标准的免疫组织化学方法，用DAB显色，用苏木素进行核染即完成（见图1）。过程中去掉使用鼠抗T-T IgG单克隆抗体的反应步骤同时也作为阴性对照。
图1 大鼠胰腺Ⅱ型弹性蛋白酶mRNA 在胰腺组织中的表达（苏木素核染，X550）
Fig.1 Expression of rat pancreatic elastase Ⅱ mRNA in rat pancreas
3 结果与讨论
大鼠胰腺组织的外分泌腺细胞的细胞质被特异性染色，呈棕色，而细胞核以及内分泌部的细胞均显示阴性，除此外，其他部分的组织细胞同样显示阴性。实验中两种阴性对照的结果均显示阴性。研究结果提示大鼠胰腺外分泌腺细胞特异性的表达胰腺Ⅱ型弹性蛋白酶mRNA，而其他组织细胞不表达。
这种运用T-T dimer特点进行原位杂交的方法具有很多优点。根据需要检测的mRNA的序列，可以任意合成相应的单链DNA探针，操作简便，适用范围广泛，不具有放射性，安全可靠，但在合成探针时应避免选择其中含有相邻T-T碱基的序列。合成的探针序列长度可以比较短，可以避免对探针进行标记的繁杂操作，因而合成的探针分子量较小，非常容易渗透进细胞中，灵敏度极高，特异性强。杂交完成后完全采用常规的免疫组织化学方法显色。在进行免疫染色前，可以在硝化纤维素膜（nitrocellulose filter）上进行点反应以确定使用抗体的合适浓度。抗T-T的抗体可进行不同的标记，灵活的选用两步或三步法进行，操作方便，并且可以根据需要进行多重染色（包括荧光染色），以及使免疫染色和原位杂交在同一张切片上同时进行，提供细胞蛋白质和mRNA表达情况的多重信息，进一步还可以运用这种方法进行Northern-blot等操作，或根据反应情况对目标基因片段进行定量检测。
【参考文献】
［1］Koji T，Nakane PK． Localization in Situ of Specific mRNA Using Thymine-Thymine Dimerized DNA Probes.Sensitive and Reliable Non-radioactive in Situ Hybridization［J］．Acta Pathologica Japonica,1990,40(11):793-807.
［2］Corinne M S, Patrice S, Lucien P,et al． Purification,Characterization and Substrat Specificity of Rat Pancreatic Elastase Ⅱ［J］．Biochemica et Biophysica Acta,1995, 1 251:55-65.