壳聚糖酶的研究进展

【摘要】  目的 壳聚糖的降解产物壳寡聚糖在医药领域中有着广泛的应用前景，而壳聚糖酶是酶法制备壳寡聚糖的专一性酶。本文综述了壳聚糖酶的研究概况，主要是壳聚糖酶的酶学特性、分离纯化以及分子生物学研究进展，同时展望了其应用前景。

【关键词】  壳聚糖;壳聚糖酶;糖苷水解酶

    Development and Potential Application in Study on Chitosanase

    CHAN Xiao-xue,ZHENG Ren-yuan,ZHANG Tao，WANG Yu-ming

    (1.School of Biological technology,Chengdu Medical College；2.Department of biochemistry & molecular biology,Chengdu Medical College,Chengdu 610083,China)

    Abstract：Objective Chitooligosaccharides,degradation product of chitosan,have extensive potential application prospect in medical field.Chitosanase are key enzyme for specifically hydrolyzing chitosan into chitooligosaccharides.In this summary,the achievement of stidies on chitosanases,including its enzymatic properties,isolation and purification,molecular biology and prospects for application was discussed.

    Key words:chitosan;chitosanase;glucoside hydrolase

    几丁质（chitin）又名甲壳素、甲壳质，是N-乙酰-D-葡萄糖胺以β-1,4-糖苷键相连而成，是地球上仅次于纤维素的第二大类天然高分子化合物。壳聚糖(chitosan)为几丁质脱乙酰化后的产物,是一种阳离子型多糖，也是目前唯一的商品化碱性多糖。壳聚糖是一种高分子阳离子絮凝剂，由于具有无毒、可被生物降解、良好的生物容性和成膜性等优良特性，在医药卫生、农业等方面得到广泛的应用［1］。如可作为离子交换剂，毛发固定剂、保湿剂和柔软剂，药物缓释剂、增溶剂，饲料添加剂，种子处理剂等。但是壳聚糖的分子量大，水溶性较差，在人体内不易吸收，使其应用受到限制。而壳聚糖的降解产物壳寡聚糖（Chitooligosaccharides）不仅具有水溶性好、易吸收等优点，近年来更是发现，低分子量壳寡聚糖（如五糖、六糖）具有抗肿瘤、抗菌、免疫激活及保湿吸湿等特点，使其在医药领域有着广泛的应用前景［1,2］。

    壳寡糖的制备大多数是以虾、蟹等为原料，经过脱乙酰基等处理得到壳聚糖，再进一步水解得到壳寡糖。目前，由壳聚糖制备壳寡糖主要有两种水解方法：酸解法和酶解法。

    酸解法一般是用盐酸部分水解壳聚糖［3］，用甲醇除去水解液中产生的大量单糖，经加Dowex离子交换树脂分离得到壳寡糖。酸水解法的缺点是反应产物单糖较多，而壳寡糖含量低，反应条件苛刻，工艺烦琐，同时这一工艺由于产生大量废弃酸液，易给环境造成污染。酶解法是指采用酶制剂在较温和的条件下降解壳聚糖。一般分为两类：非专一性水解酶和专一性水解酶［5］。非专一性酶工艺，是利用如脂肪酶、溶菌酶等壳聚糖非专一性水解酶，降解壳聚糖。但降解程度有限，而且产物复杂，不易分离，酶量使用大。专一性水解酶是利用以壳聚糖为专一性底物的壳聚糖酶，专一性水解壳聚糖，该反应条件温和，可通过反应时间控制水解产物，为大规模生产壳寡糖提供了可能，是一种较为理想的壳寡糖制备方法。壳聚糖酶（Chitosanase,EC.3.2.1.132）是催化壳聚糖降解的专一性酶。壳聚糖经壳聚糖酶降解后生成低分子量壳寡糖，壳聚糖酶在降解壳聚糖多聚物、大规模生产壳寡糖中发挥着重要作用［6］。

    1  壳聚糖酶概述

    1.1  壳聚糖酶的发现

    Monaghan在研究细菌和真菌过程中,首先提出壳聚糖酶(chitosanase,EC3.2.1.99)是一种不同于几丁质酶的新酶，能够降解完全脱乙酰化的壳聚糖,被认为是对线性的壳聚糖具有水解专一性的一种酶。在1992年国际酶学命名会议上,壳聚糖酶被系统命名。

    1.2  壳聚糖酶的分布

    壳聚糖酶主要存在于真菌和细菌细胞中,现已经从细菌（如Myxobacter，Artyrobacter，Bacillus），放线菌（如Streptomyces、Nocardioides），真菌（如Rhizopus，Penicillum，和Basidiomycete），病毒(Chlorella virus PBCV-1、CVK-2)中发现壳聚糖酶的存在，并已从发酵液中纯化得到壳聚糖酶。各种来源的壳聚糖酶的性质详见表1［9～27］。

    1.3  壳聚糖酶的理化性质

    壳聚糖酶的分子量在23～50 KD之间，低于几丁质酶的分子量(31～115 KD)。一般来说,从微生物中分离得到的壳聚糖酶分子量为20 000～40 000。但也存在少数高分子量的壳聚糖酶，如曲霉Aspergillus fumigatus KH-94有2种壳聚糖酶,其中一种酶的分子量高达108 KD［7］。但不是所有的壳聚糖酶都是单亚基蛋白，如Streptomyces griesus产生的壳聚糖酶利用变性凝胶电泳测定结果为35 000，凝胶过滤结果却为10 000，显示这种壳聚糖酶的分子结构及组成可能有别于一般的壳聚糖酶，但是其空间结构尚未确定。

    壳聚糖酶大部分为碱性蛋白，等电点（pI）变化范围比较大，在4.0～10.1之间。最适pH为4.0～8.0，Bacillus circulans WL-12的壳聚糖酶的最适pH为9.5［8］。而且Myxobacter AL-1的壳聚糖酶有两个最适pH分别为5.0和6.8。

    大多数微生物的壳聚糖酶具有较好的热稳定性，最适反应温度在30～60℃之间。在pH为6.0～8.0，37℃时壳聚糖酶非常稳定,超过40℃后酶很快失活,从Bacillus产生的壳聚糖酶的最适温度大约为60℃。Bacillus sp.strain CK4的壳聚糖酶的耐热性很高，60℃处理30 min仍然能保持全部酶活性，80℃处理30 min和60 min后剩余酶活分别为85%、66%，只有在90℃处理60 min后酶才完全失活［9］。从Bacillus sp. KFB-C108纯化的壳聚糖酶其最适温度为55℃，80℃热处理10 min或70℃热处理30 min酶活性仍然保持稳定，而且酶稳定性也比较强，但 Co2+离子能抑制酶的活性［9］。

    1.4  壳聚糖酶的催化性质

    来源于不同微生物的壳聚糖酶对不同脱乙酰化程度的壳聚糖和壳聚糖相关物(乙二醇壳杂糖、羧甲基纤维素和羟乙基壳聚糖)有不同特异性，但是一般不能降解胶体几丁质和纤维素，这也是判断壳聚糖酶和几丁质酶的一个重要标准。Hutadilok等研究了壳聚糖酶对部分N-乙酰化的壳聚糖和不同O-取代壳聚糖衍生物的水解作用的动力学行为，在均相反应中，随着N-乙酰度的提高，米氏常数Km增加，而最大反应速度Vmax降低；当N-取代的脂肪族酰基中碳链增长时，Km增加，而Vmax影响很小；对其它衍生物的水解作用则Km为：O-羧甲基壳聚糖＞壳聚糖＞O-羟乙基壳聚糖，而Vmax为壳聚糖＞O-羟乙基壳聚糖＞O-羧甲基壳聚糖。

    目前发现的壳聚糖酶大多都是诱导酶，其中一些不仅具有降解壳聚糖活性，还有其它催化作用。B.subtilis KH1壳聚糖酶则对氨基葡萄糖寡聚体(2～6聚体)具有糖基转移酶活性［11］。

    B.circulans WL-12产生的壳聚糖酶同时具有β-1,3-1,4-葡聚糖酶活性，酶的主要底物是壳聚糖和β-1,3-1,4-葡聚糖，这种广泛的底物特异性有助于B.circulans WL-12充分降解和利用真菌的细胞壁成份［12］。这种多酶活性特点可能与生物的不同生长环境有关。1.5  壳聚糖酶降解壳聚糖的作用方式及产物

    壳聚糖酶对壳聚糖的降解方式可分为内切酶和外切酶两种。大部分壳聚糖酶属于内切酶，降解壳聚糖生成壳二糖、壳三糖等寡聚体的混合物，反应速度很大程度上依赖于壳聚糖的乙酰化程度。在放线菌Nocardia orientalis和真菌Trichoderma reesei PC-3-7中分离纯化了外切型壳聚糖酶［13］。但是生物体体内并不一定只存在一种类型的壳聚糖酶。从Aspergillus fumigatus KH94中纯化出2种壳聚糖酶能被壳聚糖酶Ⅰ具有内切酶活性，能水解壳聚糖生成壳二糖；而壳聚糖酶Ⅱ则具有外切酶活性,能水解壳聚糖生成氨基葡萄糖；另外，当反应初始底物中壳聚糖含量高过2%时,壳聚糖酶 还具有糖基转移酶活性。从Aspergillus sp.CJ22-326中也分离出了两种内型的壳聚糖酶，且性质类似Aspergillus fumigatus KH94［14］。表1  壳聚糖酶的理化性质注:表示GF(凝胶过滤)法获得分子量,NA表示无法获得确切资料,ND表示未确定。

    壳聚糖酶作用部分乙酰化壳聚糖的产物经过减压浓缩后，用柱色谱(如Sephadex)洗脱，将洗脱液浓缩干燥并采用β-氨基葡萄糖苷酶(β-GlcNase)和β-乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-GlcNAcase)两种酶作用上述产物，从而可以鉴定出产物还原端的组成和产物的序列,也可以利用亚硝酸降解含有氨基葡萄糖(GlcN)残基不降解含有乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)残基的寡糖进一步确认产物的组成。

    1.6  壳聚糖酶的分类

    按照对壳聚糖的降解方式，壳聚糖酶可以分为外切酶和内切酶；按照酶的产生又可以分为诱导型（如白僵菌）［15］和组成型（如腐皮镰孢菌）［16］。但是比较公认的分类方法主要是按照酶作用底物和降解产物来进行分类。壳聚糖酶最初分为两类，一类只是分解壳聚糖，另一类可以分解壳聚糖和羧甲基纤维素。但是对壳聚糖酶的研究不断深入，由于壳聚糖酶和其他水解酶(如几丁质酶、溶菌酶、胞外N-乙酰β-D-氨基葡萄糖酶、胞外β-D葡萄糖酶)区分模糊，研究人员建议根据壳聚糖酶降解部分乙酰化壳聚糖的降解性能而分为三类,Ⅰ类酶的产物是杂合寡糖,糖的还原末端为GlcNAc,Ⅱ类酶不产生任何杂合寡糖, Ⅲ类酶的产物也是杂合寡糖，其还原末端为GlcN。所有研究过的壳聚糖酶有一个共同性质就是要求糖苷键的一侧至少有一个GlcN残基，而不能催化GlcNAc-GlcNAc键的断裂［17］。这又是壳聚糖酶与几丁质酶的一个重要区别。

    1.7  壳聚糖的制备

    目前研究公认大多数微生物来源的壳聚糖酶属于诱导酶，基因表达大多受阻遏物/诱导物系统控制，一般以壳聚糖为诱导物，它们的降解产物（GlcNAc或是GlcN）为阻遏物。因此当以壳聚糖作为唯一碳源时，微生物的产壳聚糖酶的能力就能被诱导出来。根据此理论，筛选产壳聚糖酶微生物多采用 “透明圈平板法”：即采用以壳聚糖为唯一碳源和氮源的固体培养基平板进行富集培养，限制大多数不能利用壳聚糖的微生物生长，而能产生壳聚糖酶的微生物由于能利用壳聚糖的降解产物进行生长繁殖。在这种白色不透明胶体壳聚糖平板上，由于壳聚糖被微生物降解，在产壳聚糖酶的微生物菌落周围就会形成一个透明圈，通过比较透明圈直径和菌落直径的比值，就可以初步定量的确定产壳聚糖酶活力的大小。由于天然菌株产壳聚糖酶的能力一般较低，现在大多都使用诱变育种。

    大多数的报道都是以壳聚糖作为唯一碳源诱导微生物产壳聚糖酶。Fenton等［18］用盐酸溶解壳聚糖作为微生物生长的唯一碳源和氮源，诱导Penicillium islandicum产生了壳聚糖酶。

    Pelletier等以片状壳聚糖作为唯一碳源诱导产生了壳聚糖酶，粗酶液的酶活力可达1U/ml。Shimosaka等用2%的凝胶化壳聚糖培养基诱导Frusarium solant产生了壳聚糖酶，酶活力高达9.9mU/ml。

    Shimosaka还发现氮源的成分对壳聚糖酶的产生有着较大的影响，当在培养基中添加蛋白胨、酵母粉等组成的复合氮源时，菌种产生的壳聚糖酶活力有较大幅度的提高。中国科学院的杜昱光等人利用蛋白胨、酵母浸膏和干酪素组成复合氮源，诱导球孢白僵菌产生壳聚糖酶。不同菌种生产壳聚糖酶的产酶培养条件差别不大，一般来讲的产酶最佳温度是28℃～30℃之间，pH在4.0～7.0之间。Fenton等利用Penicillium islandicum生产壳聚糖酶时，培养的初始pH为5.5，最佳产酶温度是28℃。Youshihara等采用假单孢菌生产壳聚糖酶的最佳条件为培养温度为30℃，最佳产酶pH在4.0～7.0之间［18］。

    2  壳聚糖酶的分离纯化

    目前，国内外在壳聚糖酶分离纯化方面已经做了大量研究，Masashiro等对芽孢杆菌属Bacillus cereus S1产壳聚糖酶做了分离纯化和性质研究：60 h后的发酵液3 000 r离心除去菌体，然后采用90％饱和度的硫酸铵盐析，9 000 r离心收集蛋白沉淀，将其溶于100 ml水中，使用70％冷丙酮进行抽提，沉淀离心收集后采用Sephadex G-25和Super Q Toyopearl进行分离，收集蛋白活性峰，得到电泳纯的单带蛋白，分子量约为45KD，最适pH为7.0，最适温度为60℃。该酶不仅能降解壳聚糖，而且对几丁质和纤维素有一定的降解活性。通过对该酶降解寡聚糖的产物分析，该酶是内切酶，不能降解壳二糖和壳三糖，最小降解底物为壳四糖［19］。

    Makoto［20］等对放线菌属Acinetobacter sp.Strain CHB101产壳聚糖酶进行了分离纯化工作。发酵液离心去菌体后，加入70％硫酸铵进行盐析，收集沉淀经过透析后，使用CM-Sepharose CL-6B和Sephadex G-100进行分离后，酶液比活提高了16倍，收率为16％，活性蛋白在SDS-PAGE上呈现两条带，一条分子量为30KD，一条为37KD。前者对壳聚糖有着很高的专一性，而后者则不仅能降解壳聚糖，对于几丁质和纤维素也有不同程度的降解性能。两种酶均是属于内切酶。Yoon HG［24］等对Bacillus sp菌株产壳聚糖酶进行了纯化研究。发酵液通过30％～70％硫酸铵盐析后，再使用DEAE离子交换层析，Butyl-Toyopearl层析，Tsk-Gel HW-55F凝胶过滤，得到了SDS-PAGE上单一条带，酶分子量为38KD。该酶能降解壳聚糖，但不能降解几丁质和纤维素。Co2+对酶活有将强影响。

    方祥年、杜昱光等［15］研究了球孢白僵菌胞外壳聚糖酶的纯化和性质。发酵液通过60％～90％饱和度的硫酸铵沉淀蛋白，收集蛋白透析后通过两次Sephadex G-75和Chitosan bead亲和层析，得到了在SDS-PAGE上呈单一条带的纯酶，回收率为18.75%，纯化倍数高达67.5倍。该酶除较强降解壳聚糖的活性外，能轻微降解CMC和胶体几丁质。

    Xiao Chen等研究了从Aspergillus sp.CJ 22-326中壳聚糖酶的分离纯化和性质研究。采用CM-Sepharose和Sephacryl S-200对发酵液进行分离纯化，从中纯化出两种壳聚糖酶。其中一个酶分子量为29 000，另一个为109 000。前者具有内切酶活性，后者这是外切酶活性。

    3  壳聚糖酶分子生物学研究进展

    从酶的分类学上讲，壳聚糖酶（chitosanase,EC 3.2.1.99）属于O-糖苷水解酶（O-Glycosidehydrolases,EC 3.2.1），这是一组广泛的催化2个或多个糖分子、或者一个糖分子与另一个非糖分子之间糖苷键的酶。由于酶的氨基酸顺序与分子折叠相似性之间有直接的联系，根据酶的氨基酸序列的相似性，糖苷水解酶分成不同的家族（除去不能分类的），共有87个。根据已知的壳聚糖酶氨基酸序列，壳聚糖酶分属其中的4类：46、75、80和8号［22,23］。

    46号族主要包括从Bacillus、Streptomyces、Nocardioides、Burkholderia以及病毒Chlorella virus中发现的壳聚糖酶。该族也是目前分子水平上研究最为深入和成功的一类壳聚糖酶。

    利用Nocardioides sp.N106、Streptomyces sp.N174和Bacillus.circulan MH-K1的壳聚糖酶基因的核苷酸顺序推导出氨基酸顺序后进行比较，前二者壳聚糖酶在氨基酸水平的同源性达到75%，但是后二者在中间和C-末端相差很大，只是三个壳聚糖酶的氨基酸序列中N-末端有一段保守序列，具有显著的同源性(例如B.circulan的壳聚糖酶前体氨基酸59-107和Streptomyces sp.N174壳聚糖酶前体的氨基酸44-90),这段保守序列包含在基因csn的0.38 spbl-sbcⅡ 碎片中。基因csn已经从Streptomyces sp.N174中克隆到Streptomyces lividans菌株中,大量产生壳聚糖酶［21］。

    目前，Bacillus circulans MH-K1和Streptomyces sp.N174的壳聚糖酶3级结构已被测定，Streptomyces sp.N174的壳聚糖酶3级结构与细菌噬菌体T4溶菌酶的3级结构相似。虽然Bacillus circulans MH-K1和Streptomyces sp.N174种壳聚糖酶在氨基酸序列上有20%的相似性，但总的分子构像相似，两者分子结构有3个显著差别：1在MH-K1壳聚糖酶的N末端有2个额外的α螺旋，共16个氨基酸残基，长于N174的壳聚糖酶；2MH-K1壳聚糖酶上区域的顶部α6螺旋后有2个β折叠片，而在N174的壳聚糖酶中仅有1个α5螺旋；32个壳聚糖酶的C末端的二级结构完全不同，MH-K1壳聚糖酶的C末端是α螺旋结构，而N174壳聚糖酶的C末端则是2个β折叠片。通过比较2个酶的3级结构可以得知，虽然Bacillus circulans MH-K1和Streptomyces sp.N174壳聚糖酶都同属于糖苷酶46号，但由于这2个酶的活性位点结构不同和主链取向不同，因而能识别不同的底物，催化不同的β-1,4-糖苷键，降解不同类型的壳聚糖。真菌A.oryzae IAM2 660、Nectria haematoco的壳聚糖酶基因碱基序列与来自A.fumigatus KH94和昆虫病原真菌绿僵菌Metarhizium anisopliae、球孢白僵菌Beauveria bassiana的壳聚糖酶相似，5种酶同属于糖苷水解酶家族75号，它们彼此之间显著同源，但与46号没有同源性，说明真菌壳聚糖酶在进化起源上与细菌壳聚糖酶不同。

    M.chitosanotabidus 3001壳聚糖酶氨基酸序列与Sphingobacterium multivorum壳聚糖酶高度相似，这2种酶被归类为80号。成熟的M.chitosanotabidus 3001壳聚糖酶的N端有15个氨基酸：AAAAGVIPVGDSRVY。M.chitosanotabidus 3001是一个新的壳聚糖酶［11］，氨基酸序列与蛋白质数据库中其他糖苷水解酶（包括已知的壳聚糖酶、几丁质酶及N-乙酰葡萄胺糖苷酶）没有明显的同一性。

    序列对比分析表明80号壳聚糖酶可能与46号家族的酶有着共同的、高度保守的“活性部位”组件：E-［D/N/Q］-x(8,17)-Y-x(7)-D-x-［R/D］-［G］-x-［T/S］-x(4)-G-x(5,11)-D，它包括来自B.circulans MH-K1、Streptomyces sp.N174壳聚糖酶的对维持酶活性和稳定性所必需的几个氨基酸。因此,有人建议将46号与80号归为一族。

    4  壳聚糖酶应用开发前景的展望

    壳聚糖酶在工业上可用于壳寡聚糖（Chitooligosaccharides，简称COSs）的制备，由于COSs较好的水溶性，更利于人体吸收，因而COSs在食品工业中上可作为添加剂；COSs在医药、诊断试剂等方面有着非常诱人的前景，特别是聚合度在5、6的COSs更是具有较强的抗感染、抑制肿瘤的活性；COSs具有抗菌作用，能对植物病原菌产生拮抗作用，诱导植物产生抗菌物质。但是利用化学合成方法生产COSs（尤其是具有较强生理活性的壳五糖和六糖）非常困难，产率低、生产成本较高且易污染环境，而使用专一性的壳聚糖酶通过降解生产COSs却有着高效、环保等有点，因此利用壳聚糖酶生产COSs已经成为目前研究应用的热点。

    研究发现，壳聚糖酶是一种RP蛋白，可以提高植物的抗病能力。同时利用壳聚糖酶降解一些真菌细胞壁，用以鉴定细胞壁的精细结构，可以更有效的防治病原菌，提高农作物产量。因此壳聚糖酶可以作为农业应用中的生物控制剂。

    从已报道的微生物产酶能力来看，目前获得的壳聚糖酶酶活普遍较低，纯品酶活一般都在5～250 U/mg之间，参率一般在1.2%～77%。目前报道产酶活力最高的Streptomyces sp.N174的基因工程菌所产的发酵液粗酶液酶活为36.8 U/ml［22］。这也是目前唯一的商品化壳聚糖酶。

    虽然目前壳聚糖酶已经商品化，但是由于原始的菌株产壳聚糖酶能力仍然普遍偏低，使得壳聚糖酶的来源有限，生产成本高，导致商品壳聚糖酶价格据高不下。同时现在商品壳聚糖酶在热稳定性等方面还不足以适应大规模工业化降解壳聚糖的生产。因此为了向医药工业生产提供更加廉价、高效的壳聚糖酶，一方面需要继续寻找不同微生物来源的壳聚糖酶，筛选产壳聚糖酶能力更强的菌株，寻找具有工业化潜在应用价值的新酶源；另一方面通过基因工程生产和改造现有的壳聚糖酶。

    壳聚糖原料来源广泛，其降解产物壳寡聚糖的应用非常广泛，有着及其广阔的应用前景。采用特异性的壳聚糖酶进行酶法降解壳聚糖制备壳寡聚糖，不仅有高效、产物质量好等特点，同时可以大大降低传统工艺给环境带来的污染。随着研究的深入，人们对壳聚糖酶的作用方式和特点将会了解得更加透彻，从而给生产带来更大的经济效益。

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