甘露醇及甘露醇注射液有关物质检查的研究

【摘要】  目的 建立甘露醇及甘露醇注射液有关物质的检查方法。 方法 采用高效液相色谱法（RID 检测器）进行有关物质检查。色谱柱：phenomenex Rezex RCMMonosaccharide Ca+； 流动相：脱气水；流速：1.0 ml/min。 结果 该试验条件能有效分离主峰与杂质、降解产物峰，可用于甘露醇及甘露醇注射液的有关物质检查；甘露醇及甘露醇注射液均有很好的化学稳定性，甘露醇注射液在灭菌后的储藏过程中亦未见有降解产物产生。结论 HPLC法操作简便、结果准确，可用于甘露醇及甘露醇注射液中有关物质的检测。

【关键词】  甘露醇； 甘露醇注射液； 有关物质检查

Study on Determination of Related Substances in Mannitol and Mannitol Injection

    XU Yan1, LAN Wanling1， FU Chaomei2， HE Yao2.  (1.Sichuan Food and Drug Testing Institute, Chengdu 610036, China； 2.School of Pharmacy, Chengdu University of TCM, Chengdu 610075, China)

    【Abstract】  Objective  To establish a method for determination of related substances in mannitol and mannitol injection. Methods  An HPLC method was established for the determination. The chromatography conditions were as follows: phenomenex   Rezex RCMMonosaccharide Ca+, mobile phase of degassing water；flow rate of 1.0 ml/min. Results  The test conditions could isolate the main peak and impurity peaks effectively. It could be used to determine the related substances in mannitol and mannitol injection. Mannitol and mannitol injection both have good chemical stability. Mannitol injection has no degradation products after sterilization. Conclusions  HPLC is simple，accurate and suitable for the determination of related substances in mannitol and mannitol injection.

    【Key words】  mannitol; mannitol injection; determination of related substances

    甘露醇(Mannitol)又称D甘露糖醇，分子式C6H14O6，是一种六元醇，与山梨醇为同分异构体，白色或无色的结晶粉未。其在医药工业中的应用广泛，可作为降压剂、利尿剂、脱水剂，以及片剂的填充剂、直接压片的赋形剂、咀嚼片的矫味剂、冻干粉针剂的支架剂。甘露醇注射液为甘露醇的灭菌水溶液，是上世纪60年代初即开始在我国临床上广泛使用的脱水利尿药，效果好，副作用小，经济安全可靠，应用日益广泛。

    　　药物中含有杂质会降低疗效和影响稳定性，有的甚至对人体健康有害或产生其他副作用。因此，检测有关物质、控制纯度是确保用药安全、有效，保证药物质量的重要方面。英国药典（BP2005）与欧洲药典（EP 5.0）均收载了甘露醇原料的有关物质检查项［1,2］，而现行《中国药典》（2005年版二部）中收载的甘露醇及甘露醇注射液质量标准中却未设有关物质检查项［3］。为有效控制甘露醇及甘露醇注射液中有关物质的限量，保证临床用药的安全有效，作者参照英国药典（BP2005）与欧洲药典（EP 5.0）对甘露醇及其注射液有关物质的测定方法进行了研究。

    1  仪器与试药

    1.1  仪器

    Agilent 1200 系列高效液相色谱仪，Agilent RID 检测器。

    1.2  试药

    甘露醇（市售原料药，收集了3个生产厂家，共5个批次样品）；山梨醇（生化试剂）；甘露醇注射液（市售药品，收集了11个生产厂家，共11个批次样品）。

    2  方法与结果

    2.1  色谱条件

    色谱柱： phenomenex   Rezex RCMMonosaccharide Ca（300 mm×7.8 mm  8 μm）；检测器：Agilent RID 检测器（设置温度：55℃）；柱温：80℃；流动相：脱气水；流速：1.0 ml/min。

    2.2  系统适用性试验

    　　取甘露醇与山梨醇各0.5 g,置100 ml量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,作为系统分离度测试溶液。照高效液相色谱测定法(《中国药典》2005年版二部附录ⅤD)测定，将系统分离度测试溶液20 μl注入液相色谱仪，记录色谱图，见图1～3.

    甘露醇的出峰时间约为22 min，山梨醇的出峰时间约为27 min，相对保留时间约为1.25，两者的分离度为4.59，色谱峰面积响应值比约为1.0：0.93，本系统适用性试验符合英国药典（BP2005）方法的要求。

    2.3  强制破坏试验

    取甘露醇5 g，置100 ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液（约20%浓度）；取供试品溶液5 ml，加水稀释至4倍体积(约5%浓度)，摇匀，按上述色谱条件，进样20 μl，记录色谱图，结果未经破坏的供试品溶液检测出一个杂质峰，出峰时间约为27 min，可确定为山梨醇，以归一化法计算其含量为0.36%，见图4.

    光破坏试验  取供试品溶液5 ml，置强光（4 500LX）下照射240 h，加水稀释至4倍体积(约5%浓度)，摇匀，按上述色谱条件，进样20 μl，记录色谱图，色谱图中除原有的山梨醇杂质峰外，未产生新增杂质峰，且山梨醇杂质峰的量未见增加。见图5.

    酸破坏试验  取供试品溶液5 ml，加入5 mol/L的盐酸溶液2 ml，水浴加热1 h，用5 mol/L的氢氧化钠溶液中和后，加水稀释至4倍体积(约5%浓度)，摇匀，按上述色谱条件，进样20 μl，记录色谱图，色谱图中除原有的山梨醇杂质峰外，未产生新增杂质峰，且山梨醇杂质峰的量未见增加，见图6。（注：出现在色谱图中保留时间约10 min的峰为强酸强碱破坏空白试剂产生，见图7）。

    氧破坏试验  取供试品溶液5 ml，加入过氧化氢溶液2 ml，在室温放置1 h，100℃水浴加热1 h，加水稀释至4倍体积(约5%浓度)，摇匀，按上述色谱条件，进样20 μl，记录色谱图，可见在氧化破坏试验中供试品溶液产生了少量杂质，见图9.

    热破坏试验  取供试品溶液5 ml，100℃水浴加热4 h，加水稀释至4倍体积(约5%浓度)，摇匀，按上述色谱条件，进样20 μl，记录色谱图，色谱图中除原有的山梨醇杂质峰外，未产生新增杂质峰，且山梨醇杂质峰的量未见增加，见图10.

    强制破坏试验降解产物检测结果表明，甘露醇溶液能耐受强酸、强碱、高热及强光照射的破坏，记录的色谱图中均未产生新的杂质峰，仅在氧化破坏试验中产生少量杂质；在该色谱系统中，杂质峰能与主峰基线分离，说明该色谱系统能有效检测降解杂质。

    2.4  最低检出限

    取0.01％甘露醇的对照溶液，进样5 μl，记录色图谱，此时信噪比约为3∶1，计算出最低检出限为25 ng，见图11.

    2.5  稳定性试验

    取同1份供试品溶液，分别在0 h、150 h测定，采用归一化法计算杂质的含量，结果为0.36％、0.35％，说明测定溶液150 h内稳定。

    2.6  甘露醇及甘露醇注射液有关物质检查

    精密称取甘露醇5 g或精密量取甘露醇注射液25 ml（相当于甘露醇5 g），置100 ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取2 ml，置100 ml量瓶中，加水稀释至刻度,作为对照溶液（a）(2.0%)；精密量取对照溶液（a）5 ml，置100 ml量瓶中，加水稀释至刻度,作为对照溶液（b）（0.1％）。

    取对照溶液（a）(2.0%)20 μl注入液相色谱仪，调节仪器灵敏度，使主成份色谱峰的峰高约为满量程的50%；取供试品溶液与对照溶液（b）（0.1％）各20 μl注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍，供试品溶液的色谱图中如显杂质峰，量取各杂质峰面积的和（杂质峰峰面积小于对照溶液（b）（0.1％）的主峰峰面积的不计），与对照溶液（a）(2.0%)相比较。

    取3个厂家生产的甘露醇原料药共5批以及11个厂家生产的甘露醇注射液样品共11批进行有关物质测定，结果均只检测出一个杂质峰，即山梨醇，以归一化法计算有关物质含量，见表2、表3.表2  甘露醇有关物质测定结果3  甘露醇注射液有关物质测定结果

    从检测结果可见和厂家生产的甘露醇及甘露醇注射液中其有关物质均未超过2%的限度，说明无论原料与制剂样品的有关物质均已达到英国药典（BP2005）中对甘露醇原料的要求。从时间角度来分析，各厂家生产时间不同的原料与制剂有关物质测定结果并未随生产储存时间发生显著变化。说明甘露醇原料及其注射液制剂确有很好的化学稳定性，甘露醇注射液在灭菌后的储藏过程中亦未见有降解产物产生。

    3  讨论

    3.1  关于辅料问题

    当前试验结果表明参照BP 2005方法的色谱条件, 特定杂质山梨醇与甘露醇主峰的分离度达到规定标准，可以满足甘露醇及甘露醇注射液有关物质检查的要求。由于甘露醇注射液为甘露醇的灭菌水溶液（甘露醇原料加注射用水溶解至20％浓度的溶液），其处方中无辅料，且生产工艺简单，仅有使用针用活性炭脱色、盐酸（或氢氧化钠溶液）调节pH值和高温灭菌的过程（在本次收集到的全国范围内的11个厂家的处方及生产工艺均是如此），故此试验研究的方法可直接应用于甘露醇注射液的有关物质测定，无需再补充进行辅料影响考察。

    3.2  关于山梨醇

    所收集的样品测定结果和强制破坏试验结果均表明，甘露醇供试品溶液仅对强氧化破坏稍有一些不稳定，对常规测定过程没有特殊要求。甘露醇及甘露醇注射液主要杂质峰即为其同分异构体山梨醇，几乎未见其他杂质峰。甘露醇与山梨醇在药物书籍中两者均划属为同类物质，药物类别均为脱水药，在药理上均具有利尿及脱水作用，只因山梨醇在体内部分转化为糖原而失去高渗作用，使药理作用比甘露醇稍弱。

    3.3  关于所测样品质量

    国内使用的甘露醇原料有多个生产厂家，所收集的样品有关物质含量结果在0.2％～0.8％，且所含杂质均为其同分异构体山梨醇。因中国生物制品检验所目前尚无甘露醇色谱法含量测定对照品，作者参考英国药典（BP2005）中含量测定方法，以面积归一法测得的原料含量均在99.0％以上，可见各厂家使用的甘露醇原料的质量状况均较好。

【参考文献】
  ［1］英国药典［S］.2005:1253～1254、2620～2621.

［2］欧洲药典第五版［S］.2004:1971～1973.

［3］中华人民共和国卫生部药典委员会．中华人民共和国药典（二部）［S］．北京：化学工业出版社，2005:71～72.