深黄被孢霉Δ6脂肪酸脱氢酶基因的原核表达和转基因植株再生研究

【摘要】  目的 通过农杆菌介导法将来源于深黄被孢霉的Δ6脂肪酸脱氢酶(D6D)基因导入到东北大豆绥农10和吉林47中，最终获得转基因植株。方法 利用子叶节外植体诱导出丛生芽和再生植株，利用卡那霉素的抗性筛选培养基连续筛选以及PCR方法、DNA分子杂交分析和GC分析检测转基因植株中的Δ6脂肪酸脱氢酶基因表达状况。结果 经过含50 mg/L卡那霉素的抗性筛选培养基连续筛选，获得了一批转基因植株。经PCR检测和DNA分子杂交分析，初步证明Δ6脂肪酸脱氢酶基因已导入并整合到大豆基因组中。将转基因大豆T1代和T2代种子进行脂肪酸GC分析，结果在大豆种子中检测到Δ6脂肪酸脱氢酶基因的产物GLA，证明该基因在大豆中得到了表达。

【关键词】  Δ6脂肪酸脱氢酶基因； 大豆； 农杆菌介导转化； 脂肪酸GC分析； 转基因植株

The Prokaryotic Expression and Study on Plant Regeneration of Δ6Fatty Acid Desaturase Genes from Mortierella isabellina

    WANG Guangke1，LI Mingchun2，LI Jinchuan1，XING Laijun2

    （1.Chengdu Medical College，Chengdu 610083，China；2.Department of Microbiology，Nankai University，Tianjin 300071，China）

    【Abstract】  Objective The Δ6fatty acid desaturase genes from Mortitieralla isabellina were introduced into suinong10 and  jilin47 via Agrobacterium infection method, some transgenic soybean were obtained. Methods Adentitious buds and regenerated plants were inducted from cotylendon nodes, Kanamycin resistant culture medium, PCR Southern blot and GC analysis detected condition of the Δ6fatty acid desaturase genes of transgenic plants. Result Kanamycin resistant(Kmr) transgenic plants were obtained by screening in selective condition. PCR and Southern blot analysis from transgenic plants proved that the Δ6fatty acid desaturase genes were transferred and integrated into soybean genomes. Total fatty acids extracted from the positive transgenic soybean were analyzed by gas chromatography (GC) of methyl esters to confirm the transgenic soybean containing a functional Δ6fatty acid desaturase gene. The presence of GLA indicated that the Δ6fatty acid desaturase genes from Mortitieralla isabellina were expressed in transgenic soybeans.

    【Key words】  △6fatty acid desaturase gene;Soybean(Glycin max L.);Agrobacteriummediated transformation;GC analysis of fatty acid;transgenic plant

     GLA是多烯不饱和脂肪酸1（Polyunsaturated Fatty Acid，PuFA）n6代谢路线中的一种重要的脂肪酸［1］，它作为人体必需脂肪酸（Essential fatty acid，EFAs），对人体具有双重功能，既是人体的必需营养元素，又是治疗疾病的重要药物。它在人体中可以转化为二高γ亚麻酸（DGLA）和花生四烯酸（AA），二者是合成前列腺素类物质的前体,对人体的激素调节及脂肪酸代谢发挥着重要的生理作用［2］。所以由GLA开始的一系列相关不饱和脂肪酸的研究将会在医药学、营养学、生物学等方面展开一个新的、更广阔的研究领域［3］。从亚油酸到γ亚麻酸是由Δ6脱氢酶催化的，Δ6脱氢酶是以亚油酸为底物，在C6位上脱氢形成GLA.然后，通过碳链延长和脱氢作用，进一步形成花生四烯酸、前列腺素和白三烯类等生理活性物质。由于Δ6脱氢这一步是 GLA形成的限速步骤，而且是由D6D催化的，因而D6D是GLA合成的关键因素［4,5］。近年来，先后报道了从高山被孢霉中分离出Δ6脂肪酸脱氢酶，并分别在酵母、米曲霉和烟草中获得功能性表达。

    大豆是主要的油料作物之一，富含亚油酸，而不含γ亚麻酸或含量极低。本实验室从1989年开始研究微生物发酵生产γ亚麻酸。近年来，对产γ亚麻酸的关键酶——△6 脂肪酸脱氢酶进行了克隆和序列分析，从高产γ亚麻酸的深黄被孢霉菌株中克隆出△6脂肪酸脱氢酶的结构基因，是世界上第十个克隆出该基因的实验室，在GenBank中的序列接收号为AF307934，并在酵母和烟草中得到表达［69］，这为将该基因转化到大豆中提供了前提和基础。本实验采用农杆菌介导的转化方法，将该基因转化到东北大豆品种绥农10和吉林47两个品种中，得到了一批转基因植株。

    1  材料与方法

    1．1  植物材料

    绥农10和吉林47等两个优良品种，由吉林省农科院大豆研究所提供。

    1．2  菌株与质粒

    Agrobacterium tumefaciens LBA4404，由中科院微生物所方荣祥先生馈赠。pGA643（Kanr），由内蒙古大学哈斯阿古拉教授惠赠。pTMICL6（Ampr）（全长MI D6D cDNA），南开大学真菌实验室保存。

    1．3  主要试剂

    UNIQ10柱式多用途DNA纯化试剂盒、dNTP Mix、上游引物9651、下游引物w21500均购自上海Sangon公司；限制性内切酶、T4DNA连接酶、卡那霉素、利福平和链霉素等主要购自华美生物工程公司、宝生物公司；地高辛标记和检测试剂盒购自德国Roche公司；Taq DNA聚合酶、Taq DNA plus 购自鼎国生物技术有限公司；γ亚麻酸（GLA）标准品购自Sigma公司；其余试剂均为国产分析纯。

    1．4  培养基的配制

    LB、YEB、MS及MSB培养基配方参见文献［10］。

    1．5  抗生素与激素的配制

    配制方法参见文献［10］。

    1．6  植物表达载体的构建及农杆菌的转化

    参照文献［10］的分子克隆方法构建出含有△6脂肪酸脱氢酶基因的pGMICL6表达载体，将该表达载体经电转化到LBA4404根癌农杆菌中。

    1．7  农杆菌的培养

    从保存的农杆菌平板上挑取含有表达载体的单菌落，接入含有50 mg/L Kan、25 mg/L Rif、25 mg/L Str的YEB培养基中，28℃，145 r/min振荡培养。

    1．8  农杆菌介导Δ6脂肪酸脱氢酶基因转化大豆

    挑取无病斑且种皮完好的大豆种子，清水浸泡过夜后去种皮，置于1/2 MSB 或MS固体培养基培养，几天后获得无菌苗。切取子叶节外植体并制造伤口并农杆菌菌液感染，感染后置于幼芽固体培养基中诱导分化出芽。待抗性芽在伸长培养基中长到3～4 cm后转到生根培养基中，15～20 d后可得到大豆转基因抗性小植株，当根充分发育后，将幼苗移栽到花盆。抗性再生苗在花盆里两个月开始结籽，收获后，对部分子1代的种子进行脂肪酸组成和含量的测定，其余种子种于温室中，即为T1代转基因植株。

    1．9  转基因植株的PCR检测

    取卡那霉素筛选过的转基因植株，用CTAB法提取总DNA，用于PCR扩增△6脂肪酸脱氢酶基因。上游引物序列P1(9651)：5’GGCTTCTAGAATGGCTGCTGCTCCCAGT3’（XbaⅠ）;下游引物序列P2(W21500)：5’CTGCAGATCTTTACTGCGCCTTACC3’(BglⅡ)。反应条件：94℃ 5 min→94℃ 1 min→53℃ 1 min→72℃ 2 min→35cycles→72℃ 10 min.

    1．10  转基因植株的Southern检测

    大量提取PCR反应阳性大豆转基因植株的总DNA，HindⅢ单酶切后经过电泳及转膜步骤与地高辛标记的△6脂肪酸脱氢酶基因的探针杂交，具体步骤见杂交试剂盒说明书。

    1．11  转基因大豆脂肪酸的气相色谱（GC）分析

    取一粒转基因阳性大豆种子，提取脂肪酸后进行气相色谱（GC）分析，气相色谱测定由南开大学中心实验室完成。

　　2  结果与分析

    2．1  植物表达载体的构建

    以重组质粒pTMICL6进行PCR，PCR的产物纯化后经XbaⅠ和BglⅡ双酶切获得深黄被孢霉的△6脂肪酸脱氢酶基因，经与pGA643质粒载体连接构建出含有△6脂肪酸脱氢酶基因的pGMICL6表达载体。将该表达载体经电转化到LBA4404根癌农杆菌中，并以此菌进行绥农10和吉林47东北大豆品种的转化实验（见图1）。

    2．2  预处理对诱导从生芽的影响

    在子叶节外植体获得后，转移到预培养基中培 表1  预处理对大豆丛生芽诱导的影响养24～36 h，然后进行农杆菌的感染。同时以未经预培养基培养和在预培养基培养140 h的子叶节诱导从生芽进行比较可知：未经预培养基培养的子叶节要比经过预培养24～36 h的子叶节推迟3～5 d左右出现从生芽。将子叶节预培养140 h，则子叶节诱导丛生芽率会急剧下降（见表1）。原因可能是短时间的预培养有助于切口细胞进入伤口修复反应，产生一定数量的愈伤，而长时间在诱导愈伤培养基上预培养，阻碍了细胞进一步分化生长，加快了细胞的老化及褐化过程，因而使诱导丛生芽率不断下降（见图2）。

    2．3  T1代转基因株系的种植及被转基因的遗传

    生根的转基因抗性苗种植到培养土中（见图3），经过约20 d后开始结荚（见图4），1个半月后从T0植株上收获T1种子，但种粒一般比正常的籽粒小，按株系种植在花盆中。种子的萌发率约为80 %，所有萌发的种子都开花结荚。每个株系分别单株取叶片提取DNA进行PCR扩增以检测被转基因的遗传，农杆菌介导的大豆子叶节转化结果见表2。

    2．4  转基因植株的PCR检测

    利用CTAB法提取大豆转化抗性再生苗（T0代）表2  农杆菌介导的大豆子叶节转化结果实际转化率=T0PCR阳性数/外植体总数×100%.Real frequency=T0/Total explant*100%.

    和T1代叶片中的总DNA，以材料和方法中的PCR反应条件进行扩增，电泳检测。结果在吉林47和绥农10共120棵抗性再生植株中，有75棵（其中24棵吉林47和51棵绥农10），扩增出了约1.37kb的目的带，而未转化的对照则无此目的带，PCR阳性率为63.07 %.实际转化率为1.00 %(见图5、6)。

    2．5  斑点杂交分析

    提取部分PCR检测阳性的转基因植株叶片的总DNA进行斑点杂交（见图7）。

    2．6  Southern杂交分析

    大量提取部分PCR检测阳性的转基因植株叶片的总DNA,用HindⅢ充分酶切后，进行Southern吸印和分子杂交，结果正对照（pTMICL6 PCR）和转基因植株显示特征带，负对照未转化植株则没有带（见图8）。因HindⅢ仅在△6脂肪酸脱氢酶基因以外的质粒上有一个酶切位点，因此，图中的条带数应是插入拷贝数。从图7中可以看出，吉林47和绥农10的转基因植株有一个插入位点。

    2．7  转基因大豆的脂肪酸的气相色谱（GC）分析

    把经过斑点杂交和 Southern杂交检测鉴定为阳性的转基因植株的种子单粒研磨，进行脂肪酸提取，甲酯化后，进行脂肪酸的GC分析。

　　2．7．1  吉林47转基因大豆的脂肪酸的分析  由标准品GLA（见图9A），对照（吉林47）未转化植株的种子（见图9B）和转化植株的种子（见图9C）比较可知：①图AC所示转基因大豆中出现了一个特殊峰，出峰时间为12.578 min，与标准品GLA的出峰时间12.632 min相对应，而对照未转化植株的种子中没有这一特殊峰，说明深黄被孢霉的D6D基因在转基因大豆吉林47中获得表达，其表达量占总脂肪酸的6.047 %.②GLA的出现与亚油酸含量的降低呈明显的一致关系，对照种子中亚油酸含量为54.244 %，而转基因大豆的种子中，亚油酸含量分别为51.010 %和48.987 %.

    2．7．2  绥农10转基因大豆的脂肪酸的分析  由标准品GLA（见图9A），对照（绥农10）未转化植株的种子（见图9D）和转化植株的种子（见图9E和图9F）比较可知：①图9E所示T1代转基因大豆中出现了一个特殊峰，出峰时间为12.593 min，与标准品GLA的出峰时间12.632 min相对应，对照未转化植株的种子中没有这一特殊峰，说明深黄被孢霉的D6D基因在T1代大豆中获得表达，其表达量占总脂肪酸的5.678 %.②图9F所示T2代转基因大豆中出现了一个特殊峰，出峰时间为12.598 min，其含量为6.226 %，说明深黄被孢霉的D6D基因在转基因大豆绥农10中能够稳定遗传。③GLA的出现与亚油酸含量的降低呈明显的一致关系，对照种子中亚油酸含量为57.376 %，而转基因大豆的种子中，亚油酸含量分别为54.088 %和53.313 %.

    3  讨论

    本室验采用大豆子叶节转化系统，通过农杆菌介导将深黄被孢霉Δ6脂肪酸脱氢酶基因导入到栽培大豆吉林 47和绥农10 等两个品种中。经过在含50 mg/L卡那霉素的筛选培养基中连续筛选，获得一批抗性再生植株。经 PCR 检测，得到了大约1 %的转基因大豆。经过Southern分子杂交分析，证明Δ6脂肪酸脱氢酶基因已导入并整合到大豆基因组中，将转基因大豆T1和T2种子进行脂肪酸GC分析，结果在大豆种子中检测到Δ6脂肪酸脱氢酶基因的产物GLA，证明该基因在大豆中得到了表达。此外，GLA的出现与亚油酸含量的降低呈明显的一致关系。

    本研究将深黄被孢霉Δ6脂肪酸脱氢酶基因转入大豆中，使GLA在大豆种子中得到表达，这是迄今为止，深黄被孢霉Δ6脂肪酸脱氢酶基因在油料作物大豆中成功获得表达的首次报道，极大地改善了大豆的油脂品质，并且为大豆的脂肪酸基因工程研究提供了可贵的方法和经验。本研究采用的启动子是35S，这为以后组织特异性和种子特异性启动子的相应研究奠定了基础。从栽培大豆吉林 47和绥农10的T1和T2代种子的脂肪酸GC分析可以看出，不同品种的大豆虽然导入该基因的方法相同，但最终GLA的表达量却有较大的差异，这可能与农杆菌介导的转化方法有关，因为农杆菌介导的转化方法对不同的基因差异性亦较大。现在，外源基因的分离情况和遗传稳定性正在进一步研究中，以后的研究可以采用经典的传统育种方法，培育出大豆新品系或新种质。

    另外，在利用农杆菌介导的植物转基因研究中，较小的表达载体更利于转化效率的提高，在今后的类似研究中最好采用较小的种子特异性表达载体。同时，由于农杆菌介导的转化方法其转化效率很低，今后可以尝试花粉管道转化法和基因枪法［11、12］，或者采用微弹和农杆菌相结合的方法，这两种新的方法转化效率均较高，而且目前已有相关报道。

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