小胶质细胞表达OX40L维持保护性CD4+ T细胞应答的体外研究

【关键词】  小胶质细胞;CD4+T细胞

           已知T淋巴细胞介导的免疫反应在中枢神经系统(central nervous system,CNS)的多种疾病中发挥重要作用,加重疾病进程,包括自身免疫性炎症、 微生物感染和神经退行性疾病。而近年来越来越多的证据表明其对损伤后神经细胞存活和功能修复可发挥有益作用,例如神经发生和学习记忆功能。T淋巴细胞的存活时间和活化程度直接决定了其功能发挥,但是,由于紧密的血脑屏障的保护,CNS是一个相对独立的系统,所以T淋巴细胞进入CNS后,其功能主要受CNS内部的微环境影响。那么,T淋巴细胞的存活在CNS中依赖哪些细胞和分子维持呢?

　　小胶质细胞是CNS内最主要的免疫细胞,在正常脑组织中处于静息状态,在一定因素刺激时迅速发生活化,发挥吞噬和抗原提呈功能。T淋巴细胞的活化和存活需要抗原提呈细胞表达免疫共刺激分子进行辅助。其中OX40配体(OX40 ligand,OX40L),一种肿瘤坏死因子家族成员,结合T淋巴细胞上的OX40后在维持T淋巴细胞存活和增殖、记忆性T淋巴细胞的产生方面发挥关键作用。因此,为更好地了解CNS内部保护性T淋巴细胞应答的维持机制,本研究体外用T淋巴细胞产生的前炎症细胞因子——γ干扰素(interferonγ,IFNγ)刺激小胶质细胞,观察OX40L的诱导性表达并探讨其对T淋巴细胞和小胶质细胞功能的影响。本研究中,首先分离培养C57/BL6小鼠的小胶质细胞和CD4+T淋巴细胞。小胶质细胞取自新生胞的过程。4.EOLA1和MT2A的相互作用和内皮细胞凋亡、分化及增殖的关系：很多文献表明MT2A参与调解细胞周期，与细胞凋亡、分化和增殖关系密切。EOLA1与MT2A存在相互作用，他们之间的相互作用是否参与了细胞凋亡、分化和增殖的调解。

　　初步的研究结果显示EOLA1为胞内蛋白，在ECV304细胞中呈全细胞分布，有胞核聚集现象;哺乳细胞双杂交和免疫共沉淀实验证实MT2A与EOLA1在哺乳细胞内存在相互作用关系;EOLA1和MT2A在ECV304细胞中存在共定位现象，主要定位于细胞核和核膜周围;应用RNA干扰技术对EOLA1进行基因沉默，然后利用细胞计数和流式细胞仪技术观察EOLA1下调表达对ECV304细胞增殖的影响，结果发现EOLA1基因被抑制可以促进ECV304细胞的增殖。关于其机理目前尚无任何线索，我们推测EOLA1可能是通过MT2A对细胞的增殖发生影响。在将来的研究中我们将进一步了解清楚MT2A与EOLA1的相互作用关系，建立EOLA1上调和下调表达模型，通过这些模型观察LPS刺激对MT2A表达的影响及细胞增殖的改变。这些研究为全面认识EOLA1的功能奠定了基础。1～2 d的小鼠大脑皮层,用0.25%胰酶消化组织,巴氏吸管机械吹打后经200目不锈钢筛网过滤为单个细胞悬液。加入含10%胎牛血清的IMDM培养基(Iscove’s modified Dulbecco’s medium),采用贴壁和振荡法纯化小胶质细胞。用小胶质细胞标志物CD11b和F4/80抗体辅以DAPI核染荧光显示细胞核,计数分离细胞的纯度;为诱导OX40L的表达,在培养液中加入重组小鼠 IFNγ(20 ng/ml)，使用重组小鼠OX40和IgG Fc融合蛋白 (mOX40Fc,1 μg/ml)交联激活OX40L,以小鼠 IgG Fc (mIgFc)作为对照。CD4+ Th细胞用免疫磁珠阴性分选法从小鼠脾脏中纯化。其次,用实时定量RTPCR、Western blot和流式细胞术检测小胶质细胞上OX40L和IGFI的表达。再次,用[3H]TdR掺入法检测IFNγ活化后小胶质细胞对T淋巴细胞增殖的影响。最后用annexin V 和碘化丙啶双染法检测对T淋巴细胞凋亡的作用。研究结果显示:① IFNγ可诱导小胶质细胞表达OX40L.定量RTPCR结果表明OX40L的mRNA表达水平在IFNγ作用下明显升高,Western blot结果表明OX40L在小胶质细胞上无组成性表达,而IFNγ可使其表达OX40L蛋白。流式细胞仪分析也显示OX40L阳性的小胶质细胞在加入IFNγ后显著性增加。并且小胶质细胞上OX40L的RNA和蛋白表达水平与IFNγ的剂量呈正相关;②小胶质细胞表达OX40L促进CD4+ T淋巴细胞增殖。由于OX40只表达于活化后CD4+ T淋巴细胞,因此先用抗CD3单抗淋巴活化T细胞。将IFNγ刺激后表达OX40L的小胶质细胞与活化后表达OX40的CD4+ T淋巴细胞以1∶1、1∶2、1∶4和1∶8的不同比例共培养,结果显示可以促进CD4+ T淋巴细胞,当比例为1∶4时效果最显著。 当用抗OX40L中和性抗体阻断OX40/OX40L信号通路时,CD4+ T淋巴细胞的增殖明显下降。为进一步证明小胶质细胞对 CD4+ T淋巴细胞的促增殖作用不是通过分泌性细胞因子产生,我们使用了跨膜共培养(transwell cocultures);③小胶质细胞表达OX40L抑制CD4+ T淋巴细胞凋亡。而用抗OX40L中和性抗体后CD4+ T淋巴细胞凋亡的比例又明显增加。与T淋巴细胞跨膜共培养的小胶质细胞则对其凋亡无抑制作用;④小胶质细胞表达OX40L促进其分泌胰岛素样生长因子I (insulinlike growth factor I,IGFI)。小胶质细胞分泌的IGFI对CNS具有保护作用,而交联OX40L后明显促进其IGFI在mRNA和蛋白水平的表达。李茂全,等.小胶质细胞表达OX40L维持保护性CD4+ T细胞应答的体外研究

　　根据以上研究结果,可初步得出以下研究结论:① IFNγ活化的小胶质细胞显示的表型明显不同于静息状态,尤其是OX40L表达显著;② 小胶质细胞表达的OX40L对CD4+ T淋巴细胞的增殖有促进作用; ③ OX40L信号在小胶质细胞抑制CD4+ T淋巴细胞凋亡过程中发挥功能;④ OX40L信号是双向传导信号,可以促进小胶质细胞分泌IGFI从而有益于CNS损伤后修复。长久以来,CNS中的自身免疫反应被认为有破坏性作用,近年来大量研究表明T淋巴细胞在正常和病理条件下均对CNS的自稳和修复发挥有益的作用。但是,T淋巴细胞在CNS这样一个相对独立器官内的存活机制缺乏相关探讨。本研究初步证明CNS内固有的抗原提呈细胞——小胶质细胞在IFNγ活化后表达的OX40L能够帮助CD4+ T 淋巴细胞增殖,抑制其凋亡;但阻断OX40OX40L信号通路并未完全抑制小胶质细胞对T细胞的作用,提示小胶质细胞上很有可能还存在其它分子或机制共同精确地调控T细胞的增殖或凋亡。同时,OX40L信号被激活可反向传导使小胶质细胞分泌利于CNS修复的细胞因子。总之,本研究有助于了解CNS内部T淋巴细胞免疫的存在机制,为CNS内相关疾病的防治提供新思路。