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【摘要】 生物体均存在调控生命活动的近日节律(circadian rhythm)以适应外界环境的变化。近日节律的产生是一系列生物钟基因的转录和转录后调控所引起的分子振荡。近日节律基因除了在产生生物节律方面使机体更适应外环境以外,还广泛影响着许多与近日节律无关的生命活动。实际上,很多看似与近日节律没有直接关系的生理病理现象,都受到近日节律基因的影响。
【关键词】 昼夜节律;基因;生物钟;非生物钟效应
【Abstract】 The biorhythms of every species are precisely regulated to adapt the environmental changes. The function of biorhythms is controlled by the clock genes in either a single cell or the whole body. The function of clock genes depends on the feedback circles that are composed by the interactions among the clock components. Many studies indicate that circadian clock is closely related to diseases. Several diseases show overt circadian rhythms,indicating that clock genes may play an important role in such kinds of diseases.
【Key words】 circadian rhythm; genes; bioclock; nonbioclock effect
几乎各种生物的生理、生化和行为过程中都表现出一定的昼夜节律变化。昼夜节律生物钟(circadian clock)就是设定并调控机体出现这种昼夜周期的系统,是一种以近似24 h为周期的振荡器(oscillator),是机体为了更好地适应环境,在进化过程中自然选择作用下获得的。人体的许多生理、病理现象均有着明显的昼夜节律,生物钟基因在机体的多种生理功能以及多种疾病的病理过程中均起着重要的作用。大量有关近日节律功能研究的报道结果显示,很多看起来和近日节律没有直接关联的生理病理现象都受到近日节律基因的影响。本文就近年来生物钟基因的一些非生物钟效应的研究况作一综述。
1 生物钟基因研究概况
总体来说,生物的昼夜节律是由PER和TIM、CLOCK和BMAL1等4个生物钟“齿轮”组成的正负调节回路控制的。它们通过PAS域分别形成异型二聚体进入核内,调节Per和Tim的转录,从而使得Per和Tim mRNA呈现周期波动。CLOCK自身的周期波动协调了这个过程。光可以影响PERTIM的结合以及PER的磷酸化过程,从而影响PERTIM进入核的时间,导致PER和TIM的相移。目前研究得较多的生物钟基因有Clock、Period、Bmal1、Timeless、Cryptochrome基因等。
2 生物钟基因的一些非生物钟效应
生物钟基因还在不断地被发现,人体的多种生理过程如睡眠和清醒、体温、血压、激素分泌、免疫功能均呈现昼夜节律变化,这种节律的改变会对健康造成重大影响。失眠、时差反应以及肿瘤等均被认为与生物钟相关。多种疾病均呈现出明显的昼夜节律,提示这些疾病与昼夜节律生物钟有密切的关系。
2.1 生物钟基因与肿瘤发生及生长的关系
运用时间生物学理论及研究方法探索肿瘤细胞的基因表达时间特征,已经成为当前肿瘤研究的课题。大量研究结果证实,肿瘤的发生、发展与生物钟基因的关系非常密切[1]。
Per基因是哺乳动物主要的节律调节基因,其在SCN及外周组织的表达均有明显的昼夜节律特征。通过动物自发性转轮活动观察,mPER1和mPER2缺失的小鼠的昼夜节律完全紊乱,且动物出现过早老化,接种肿瘤后新生肿瘤的生长速度明显加快[2]。mPer2突变的小鼠中,一些与细胞周期调节有关的基因,如原癌基因cMyc、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、细胞周期调节蛋白A(Cyclin A)、鼠双微基因2(Mdm2基因,其产物MDM2是一种锌指蛋白,能够结合P53蛋白和使P53的转录调节功能失活),以及抑癌基因Gadd45α的表达均与野生型小鼠的周期性表达有关,从而说明生物钟基因在细胞周期和生长调节中有重要作用,是维持内环境稳定的重要因素[3]。mPer2基因缺陷小鼠有易患癌症的倾向,γ辐射攻击后,mPer2基因缺陷小鼠小鼠肿癌发生率明显上升,胸腺细胞细胞凋亡减少[4]。
还有研究者设计PCR引物,应用荧光探针分析了9种生物钟基因mRNA水平,并用免疫组化方法分别研究了4种核心钟基因在35例子宫内膜癌患者和35例健康妇女子宫内膜组织的表达,结果提示子宫内膜癌患者子宫内膜组织的生物钟基因表达异常,该研究结果对肿瘤的时间治疗学提供了一定的分子生物学依据[5]。另外,Per基因与其他一些肿瘤也关系密切,如神经胶质瘤模型大鼠Per1基因转录异常[6]。
对Clock基因突变的小鼠的昼夜节律的研究提示,自由运行状态时突变小鼠的昼夜节律周期增加了4～5 h,与LD12︰12状态下的突变小鼠比较,自由运行状态下Clock基因突变小鼠的体温节律的振幅增加了45.9%,自发性活动的振幅增加了17.4%,且这种昼夜节律周期的延长的小鼠,接种肿瘤后,在DD状态下肿瘤的生长速度明显减慢[7]。
关于生物钟基因缺陷与肿瘤发生的机制研究上,目前多集中于生物钟基因通过直接或间接调控、干扰细胞周期及调亡程序、原癌基因、抑癌基因的表达等方面。另外,生物钟基因启动子 CpG位点出现甲基化损伤也是当前肿瘤发生机制的研究热点。
小鼠Lewis 肺癌细胞系(LLC)和乳癌细胞系(EMT6)中mPer2基因的过表达,导致细胞过度增殖和凋亡,且原癌基因cMyc、BclX(L)和Bcl2水平明显下调,抑癌基因p53 和bax则明显上调,说明mPer2可能通过调节细胞调亡过程抑制肿癌生长[8]。
体外培养Lewis肺癌细胞,使用脂质体包裹法将真核表达质粒pcDNA3.1为基础的mPer2表达质粒(pcDNA3.1mPer2)转导入Lewis肺癌细胞内,结果发现mPer2表达质粒(pcDNA3.1mPer2)转染的Lewis肺癌细胞表达PERIOD2蛋白的增殖指数下降,细胞凋亡率增加,提示节律基因mPer2可以抑制肿瘤细胞的生长,增加肿瘤细胞的凋亡率[9]。
在肿瘤发生的机制上,目前对生物钟基因启动子 CpG位点出现甲基化损伤的研究较多。生物钟基因Bmal1/Npar2或Clock/Bmmal1异二聚体可能过抑制原癌基因启动子p1和p2直接抑制其转录,而mPer2则通过促进Bmal1转录间接抑制原癌基因的转录。通过对35例子宫内膜癌(EC)患者和健康对照者子内膜组织的研究发现,1/3患者和1/5健康女子宫内膜组织Per1、Per2和Cry1启动子CpG位点出现DNA甲基化[10]。应用RTPCR和免疫组化的方法,有31.4% 的子宫内膜癌子肿瘤组织中Per1基因CpG出现甲基化现象,正常子宫组织仅有11.4%出现甲基化(P<0.05)[11]。
有人应用微点阵的分析方法筛选肿瘤抑制基因,经鉴定发现,生物钟基因的核心基因Per1,在肺部的表达与肺癌的生长关系密切。尽管正常人的肺部Per1水平也较高,但其在非小细胞肺癌(NSCLC)患者肺部细胞内的表达却极低。研究表明,DNA超甲基化及组蛋白H3乙酰化是NSCLC患者Per1表达降低的潜在原因,提示昼夜节律紊乱在肺肿瘤的发生中具有重要作用[1213]。
还有研究者发现,通过对53例健康人及35例慢性髓细胞样白血病(chronic myeloid leukemia,CML)的患者外周血中9种生物钟基因表达产物的分析发现,无论是急性期还是稳定期的CML患者,其外周血中hPER1,hPER2,hPER3,hCRY1,hCRY2 与 hBMAL1的水平均明显低于健康对照者(P<0.001),其中所有CML患者的hPER3的启动子 CpG位点出现甲基化损伤,急性期患者hPER3的 CpG位点甲基化更加明显(8.24±0.73),稳定期CML的情况稍好(2.48±0.48),另外有40%的CML患者的hPER2的 CpG位点有甲基化。该结果提示CML患者hPER3的下调与其CpG位点甲基化有关[14]。
对55例中国台湾乳腺癌患者手术切除标本应用免疫组织化学、PCR以及直接测序法进行研究,发现有95% CH的肿癌细胞中Per基因的表达与周围正常细胞不一致,但并非基因突变,而是由于Per基因的启动子甲基化,从而使癌基因cerbB2过表达所致。因此推测钟基因的启动子因甲基化而失活,从而抑制Per基因的转录和翻译过程,导致cerbB2过度表达而发生乳腺癌[15]。
2.2 生物钟基因与心血管疾病的关系
多种心血管生理功能都具有明显的昼夜节律,一些心血管病变如心肌缺血的发病也显示了节律性,通常这些疾病在清晨高发。这提示了心血管生理功能、心血管疾病与昼夜节律生物钟有着密切的关系。当前,已经公认维持稳定的昼夜节律对保持正常的心血管功能,减少心血管事件的发生具有重要意义,但其在心血管疾病的发生中的重要性尚需进一步研究。
心肌梗死和中风的发病率明显有昼夜变化,这与血压及心率的昼夜节律有一定关系。Bmal1/基因敲除小鼠的心率的24 h节律消失,出现亚24 h的超日节律。Clock(mut)基因突变,或者Npas2(mut)基因突变的小鼠,心血管功能也出现不同程度的异常[16]。有作者建立心肌肥大失代偿小鼠模型,分别置于光照周期为20 h和24 h的环境中,超声心动图显示,置于周期为20 h的环境中的小鼠,其左室收缩期和舒张期内径增加,心率的昼夜节律紊乱,RTPCR分析发现,其心肌、血管平滑肌细胞及视交叉上核生物钟基因的转录与周期为24 h的小鼠明显不同,per2 和 bmal mRNA水平降低,同时与心肌肥大相关的基因水平下调(心房钠尿因子ANF、脑钠素BNP、血管紧张素转化酶ACE和胶原质collagen等)[17]。
研究发现,Per2对内皮功能的作用比较明显。有研究显示Per2基因突变小鼠的主动脉环出现明显的内皮功能异常,但环氧合酶抑制因子吲哚美辛可改善这种异常现象,且观察发现突变小鼠的大动脉中乙酰胆碱M3受体及内皮一氧化氮合酶蛋白的表达没有明显变化,但环氧化酶1(非环氧化酶2)蛋白水平明显升高,且这种内皮功能异常与血压及血脂的关系不明显,该研究结果表明Per2基因对维持心血管内皮功能有重要意义[18]。此外,ET1可以引发Per1、Per2、Per 3基因的表达增加,随后引发多种生物钟成分如PER 蛋白、dbp及Bmal1的周期性表达[19]。
Nonaka等发现,小鼠的主动脉中mPer2、dbp、Baml1 有明显的节律振荡。短暂给予血管紧张素Ⅱ可引起mPer2 基因的强烈表达,随后引起生物钟其它成分的同步周期性振荡。这一作用是通过血管紧张素Ⅱ1型受体介导,因为阻断该受体后,mPer2 高表达现象消失。这提示血管紧张素Ⅱ可能参与其靶器官如主动脉、心脏、肾脏中生物钟基因表达的调节,以应答环境的改变,这些改变可能导致心血管功能紊乱。但目前仍不清楚生物钟基因在血管平滑肌中起到什么作用[20]。
在高血压的发病方面,对Dahl盐敏感大鼠的研究发现,给予高盐饮食6周诱导高血压形成后,大鼠每日血压的节律波动的振幅增大,而外周器官心脏、肝脏、肾脏的生物钟基因mPer2、Bmal1、dbp 昼夜节律振荡与常规饮食的对照组相比振幅减小,但肝中Bmal1例外[21]。
2.3 生物钟基因与骨性关节炎、骨形成等的关系
研究显示,生物钟基因与骨形成及骨重建等关系密切,Bmal1/基因缺失小鼠在出现明显的昼夜节律紊乱的同时,也伴有肌腱钙化、活动减少、体重减轻,以及寿命延长等表现,提示Bmal1基因与运动系统有一定关系[22]。
研究者将离体小鼠软骨细胞培养于三维海绵中,观察机械应激对骨性关节炎软骨细胞的基因表达的影响。通过对位于骨性关节炎软骨细胞的细胞浆、细胞骨架、细胞核中12 000多种基因的大规模DNA微点阵分析,发现钟基因Clock、Per1和Per2基因在软骨细胞中均有表达,并在血清性休克后呈现典型的昼夜节律。提示钟基因在骨性关节炎软骨细胞受机械应激后的代谢调节中具有重要作用[23]。此外,有人观察不同钟基因在体外培养的小鼠股骨软骨细胞发育过程中的功能性表达情况,结果发现Ⅰ、Ⅱ和Ⅹ型胶原的mRNA均呈明显的24 h昼夜节律,峰相位为ZT6(ZT即zeitgeber time,授时因子时间)。体外观察发现,甲状旁腺素(PTH)能够迅速提高成骨细胞MC3T3E1和软骨细胞ATDC5中Per1 mRNA和Per2 mRNA水平,但对Per3 mRNA无影响。PTH通过蛋白激酶ACRE凝结蛋白信号通路直接mPer的表达[24]。
成骨细胞的活性受激素调节,目前已经证实中枢性激素来普汀(leptin)可抑制骨形成。脑室内灌流来普汀可减少骨沉积,而交感神经系统可调节来普汀的分泌,儿茶酚胺类分泌不足可使骨量降低,β受体激动剂亦可降低骨沉积,而β受体阻断剂则可使骨量增加[25]。因而,可认为来普汀是一种调节骨重建的激素,在维持骨量稳定中具有重要作用。钟基因(Per和Cry)缺陷小鼠,格根包尔氏细胞中Per表达降低,表现出骨量增加,提示骨的再建受生物钟基因的调节。此外,Per基因缺陷小鼠,脑室灌流来普汀后骨量也会出现反常增加。钟基因在格根包尔氏细胞的表达受交感神经系统和来普汀的调控,反之钟基因也可通过抑制细胞周期调节蛋白G1的表达来介导交感神经系统的抗增殖作用。因此得出结论:来普汀对骨形成过程的调节作用,受生物钟基因的影响[26]。在生命早期,Per和Cry基因突变小鼠呈现高骨量发育,成骨细胞数量增加,且这种增加不能被脑室灌流来普汀来纠正,因而推断分子钟在骨形成中具有重要作用[27]。
2.4 生物钟基因在创伤镇痛及手术后应激的关系
大外科手术后,患者的昼夜节律紊乱的现象十分普遍,围手术期患者往往会伴有一些昼夜节律紊乱的症状如失眠、谵妄等。这与术后睡眠障碍、疲劳、认知机能障碍、心血管机能异常有关,但围手术期褪黑激素、皮质醇、核心体温节律的变化也起着关键作用。Gogenur等[28]对11例腹部大手术后患者的监测发现,褪黑激素、皮质醇、核心体温等的变化可作为术后机体节律变化的标记性指标。为了解此节律变化与生物钟基因的相关性,Azama等用RTPCR的方法,每天6个时间点检测了食管癌和早期胃癌术后,住院患者外周血单核细胞中hPer1和hPer2 mRNAs的转录情况,同时用放射免疫测定法检测患者血浆褪黑激素及皮质醇的含量。患者进行食道切除和早期胃癌切除术后,外周血单核细胞中生物钟基因的表达峰相位时间改变的情况分别为:hPer1,从6∶19±1∶50变为13∶59±0∶59(P=0.0003),从 7∶47±1∶27变为12∶33±1∶30(P=0.0043);hPer2,从5∶01±2∶59变为19∶30±2∶15(P<0.0001),从6∶49±1∶59 变为13∶39±3∶06(P=0.0171),食道切除术后hPer2的相位改变更为明显。此结果显示手术应激影响了生物钟基因的转录和表达[29]。
2.5 生物钟基因与支气管哮喘发生的关系
由于支气管哮喘经常在午夜和凌晨发作,哮喘发作和生物钟基因具有一定的相关性,且糖皮质激和β肾上腺素受体激动剂亦可影响生物钟基因的表达[30]。研究结果显示糖皮质激和β肾上腺素受体激动剂可诱导人支气管上皮培养细胞及外周血中Per1 mRNA转录[31],提示根据生物钟基因的表达时相对治疗支气管哮喘具有重要的临床意义[32]。
糖皮质激素受体激动剂地塞米松是治疗哮喘的推荐用药,研究发现服用地塞米松能明显提高哮喘模型小鼠肺部组织mPer1的表达,但对肝的mPer1表达无明显影响。连续6 d分别在ZT0(开灯时间)或ZT18(关灯后6 h)吸入地塞米松,可造成肺部组织mPer1的表达相位超前或滞后,类似于光照导致的动物自发性活动节律相位的超前或滞后。ZT0吸入地塞米松可降低mClca3基因的表达,且使其节律峰相位超前,此基因与过量产生黏液有关。提示生物钟基因的表达与哮喘的发作及激素类药物的作用有关[33]。于早晨10:00获取2例白天活动(大约07:00～23:00处于活动期)的健康者的支气管上皮细胞(BEAS2B)和外周血单核细胞(PBMCs),应用RTPCR方法观察体外地塞米松刺激对hPer1 mRNA的表达情况,结果发现可导致hPer1 mRNA水平明显升高,提示糖皮质激素质可迅速影响PBMCs中hPer1 mRNA的转录过程[34]。
2.6 生物钟基因与毒品成瘾及药物依赖的关系
大量研究证实,机体对不同种类的精神兴奋剂的敏感性均受昼夜节律的影响[35],生物钟基因在药物依赖中扮演着重要的角色,尤其是CLOCK、PER1 和PER2作用特别明显[36]。
在影响日节律改变的基因中,period基因(简称Per基因)与毒品成瘾的关系最为密切。目前至少已鉴定出3种Per基因亚型(Per1、Per2和Per3),啮齿类动物中SCN中3种Per基因亚型mRNA在12 h光照和12 h黑暗(LD)的光制条件下,其mRNA水平的峰值出现在白天,或在持续黑暗(DD)的光制条件下,峰值出现在主观白天,而Per1(早晨)和Per2(黄昏)的峰值时间有所不同[37]。啮齿类松果体Per1和Per2 mRNA水平的峰值均出现在主观黑夜,这与SCN有着明显的区别[3839]。 Per基因可影响机体对可卡因的行为反应。有学者研究发现,可卡因成瘾性与纹状体Per1的水平密切相关[40],通过对不同遗传背景的小鼠AKR/J(NAS/MT不足)、CBA/J(NAS/MT正常),以及SD大鼠(NAS/MT正常)的自发活动测定及PER1蛋白水平的分析发现,NAS/MT正常动物的PER1水平具有明显的昼夜节律特征,且在夜间(ZT20～21)对3次注射可卡因后的敏感性没有明显变化,而白天(ZT05)却随着注射的次数增加,敏感性逐渐升高;而对NAS/MT的AKR/J小鼠,则无论白天还是夜间对多次注射可卡因的敏感性均有增加,说明毒品是通过调节松果体产生N乙酰羟色胺(NAS)及褪黑激素的水平,从而使人体节律发生改变[41]。通过对小鼠进行条件性位置偏爱实验,发现假手术组小鼠的可卡因的奖赏效应在夜间明显低于白天,而切除松果体的小鼠则无明显变化,提示松果体可节律性调节可卡因等毒品造成的成瘾性[42]。进一步研究发现,松果体合成并分泌的褪黑激素是影响生物钟基因Per1表达的关键因素。通过对雄性C3H/HeJ小鼠的研究发现,在一个昼夜节律周期中,纹状体Per1 mRNA水平较PER1蛋白水平的高峰时间提前了16 h,此过程受褪黑激素水平及纹状体中褪黑激素受体水平的控制。松果体切除小鼠的纹状体中Per1 mRNA水平和PER1蛋白水平均没有明显的节律性,且Per1基因突变的小鼠对可卡因不敏感[40]。
松果体的分泌产物褪黑素可降低机体对可卡因的成瘾性。其中褪黑素合成的关键限速酶N乙酰基转移酶(Nacetyltransferase,AANAT)的水平具有关键作用,在夜间其水平上调将会影响机体对可卡因的敏感性。通过对小鼠腹膜注射可卡因(10 mg/kg、 20 mg/kg),正常动物(C3H/HeJ)及AANAT突变小鼠(C57BL/6J)的自发性活动均具有剂量依赖性增强,但连续3 d注射可卡因,白天注射时两种动物均可致敏,但夜间注射则只有AANAT突变小鼠致敏,提示ANATT及褪黑素在可卡因的成瘾机制中具有重要作用[43]。我国也有学者通过设计针对mPer1 mRNA的核酶,构建以真核表达质粒pcDNA 3.1为基础的per1RZ表达质粒,脑室注射后能够有效干扰小鼠中枢神经系统Per1基因的表达,阻断吗啡条件性位置偏爱的形成[44]。
此外,生物钟基因在酒精依赖的作用目前也研究得较多。研究发现,Per1和Per2在精神依赖中具有重要作用[45]。通过对雌性受孕大鼠的研究发现,在其妊娠第10～21 d喂饲一定量酒精,胎鼠成年后下丘脑弓状核中阿片促黑素细胞皮质素原(简称阿黑皮素,POMC)mRNA编码的内源性阿片肽β内啡呔的昼夜节律较正常对照组明显不同,且其弓状核内rPer1、rPer2和rPer3及视交叉上核中rPer1 和rPer 2 mRNA的昼夜节律性表达也出现紊乱,提示胎儿期受到精神影响,可导致出生后β内啡呔神经元功能的昼夜节律发生紊乱[46]。另外连续2周大量饮用含酒精饮料,也可导致下丘脑内β内啡呔神经元POMC mRNA的表达失节律,且弓状核中Per1和Per2 mRNA也会出现紊乱[47]。
2.7 生物钟基因与精神障碍性疾病的关系
昼夜节律系在精神障碍性疾病如双相性精神障碍(BPD)、严重抑郁(症)、季节性情感障碍(SAD)等的发生中具有重要作用,提示生物钟基因与精神障碍性疾病的发生发展密切相关[48]。
双相情感性疾病(bipolar affective disorder,BPAD),尤其是双相性精神障碍(bipolar disorder,BD)是一种兼有躁狂与抑郁两种表现的精神障碍性疾病,近期研究发现BD的发生与体内一些生物钟基因的表达异常密切相关。通过单基因排列试验,对具有BD家族史的52个家族共182位患者的10种钟基因表达产ARNTL、CLOCK、CRY2、CSNK1ε、DBP、GSK3β、NPAS2、PER1、PER2和PER3与BD发病率的相关性评估研究发现,CSNK1ε的异常与BD的发生有一定关系,但与ARNTL和PER3关系最为密切[49]。另外,Cry1与BD的发生也有一定关系[50]。通过基因定位图谱研究发现,BD的复发亦与生物钟基因的功能异常有关,并建议制作一种BD的生物钟基因的“内在表型”,将有助于BD的鉴别诊断和分型,并进行遗传分型[51]。
精神分裂症的发病有明显的昼夜节律。通过对12例精神分裂症患者及14例健康对照者的颞中回大约12 000种基因的微点阵分析,与精神分裂症关系最为密切的基因有髓鞘形成相关基因MAG、PLLP(TM4SF11)、PLP1和ERBB3基因。另外与神经发育有关的基因,以及生物钟基因Per1也与发病有高度相关性[52]。因而,将生物钟基因异常作为精神分裂症的“内在表型”,将有助于其亚型的诊断和鉴别。进一步研究发现,位于染色体12q23～q22.1的Cry1基因,与精神分裂相关基因(位于12q24)非常靠近,近期研究表明Cry1基因可干扰抗精神病药及多巴胺系统的作用,因而其在精神分裂症的病理生理中具有重要作用,据此推测Cry1为精神分裂症发病的候补基因[53]。
另外,Clock基因的表达产物CLOCK蛋白在躁狂症的发生中有重要作用。研究发现Clock基因突变小鼠明显出现极度活跃、睡眠减少,对可卡因、蔗糖的敏感性增高,前脑内侧束兴奋性增加,腹侧被盖区的多巴胺能神经元活性增加。通过特定的病毒介导基因转移植入CLOCK蛋白后,这些异常可逐渐恢复。这些研究结果提示CLOCK在多巴胺能系统对行为和情绪的调节功能中起重要作用[54]。此外,在季节性情感障碍中生物钟基因也有一定作用[55]。
2.8 生物钟基因与脂肪代谢的关系
昼夜节律反馈调节中,正向调节因子(CLOCK和BMAL1)及负向调节因子(PERIODs、CRY1 和CRY2)对许多生理机能如细胞周期、脂类代谢等均会产生影响[56]。肥胖症的发生与多种因素,如来普汀、乙二腈,以及一些肥胖衍生细胞因子有关,近期研究发现,也与生物钟基因有一定关系。有研究者观察了核心钟基因(Npas2、Bmal1、 Per13、Cry12)和钟控基因(Reverbα、 Reverbβ、 Dbp、E4bp4、Stra13、Id2)在脂肪组织中的表达,通过对大约650种基因的微点阵分析发现,生物钟基因与肥胖症、2型糖尿病等代谢性疾病的发生发展密切相关[57] 。
2.9 生物钟基因与女性生殖系统的关系
生物钟基因,如Arntl、Clock、Per1、Per2和Cry1等在性腺均有表达,动情性前期黄体生成素的分泌能促进Arntl 的表达,人绒毛膜促性腺激素(hCG)能够诱导垂体切除的幼龄大鼠的Arntl和Per2基因的表达产生物,提示生物钟基因与性腺功能有一定关系[58]。
2种核心钟基因Per1和Per2在大鼠卵巢表达均呈明显的昼夜节律,有人对此进行了研究。将大鼠分为3组,其中一组是动情前期处于LD 12︰12光照,另一组在整个动情周期的4 d均给予LD12︰12光照,第三组则在整个动情周期的4 d均持续黑暗。通过RTPCR研究显示,Per1 mRNA水平在ZT0～ZT2处于谷值,ZT12～ZT14处于峰值,Per2 mRNA较Per1 mRNA延迟约4 h.通过原位杂交和免疫组织化学的方法,Per mRNAs主要位于具有生成类固醇作用的排卵前卵泡细胞、黄体,以及腺体间质细胞中,研究者同时还动态观察了细胞内PER1和PER2蛋白水平。结果显示,生物钟基因卵巢的表达与其在下丘脑垂体性腺轴的作用密切相关[59]。由于Per1基因在小鼠的卵母细胞及果蝇卵中大量存在,故有人将其视作一种“生殖基因”,它位于小鼠染色体11,牛的染色体19,均为染色体的数量性状遗传位点(quantitative trait loci,QTL),能够对动物的排卵产生影响。通过RTPCR和原位杂交研究显示,动情周期的不同时间点母牛卵巢皮质的Per1 mRNA水平不同,提示Per1基因对卵泡发育有一定影响[60]。
通过RTPCR的方法,发现大鼠卵巢中存在一些核心生物钟基因(Arntl、Clock、Per1、Per2、 Cry1)mRNA,且黄体生成素(LH)可提高动情前期卵巢Arntl转录水平,人绒毛膜促性腺激素(hCG)治疗可提高垂体切除的幼龄大鼠Arntl和Per2的表达水平,提示LH是卵巢中生物钟基因表达的潜在调节因子[61]。另外,通过原位杂交和Northern blotting的方法,研究雌性激素雌二醇(E2)对卵巢切除大鼠中枢(SCN和大脑皮质)、外周(肝、肾及子宫)Per1和Per2基因表达情况。在中枢,E2能使SCN中Per2 mRNA表达的峰相位提前,但对Per2 mRNA在大脑皮质中表达,以及Per1 mRNA在SCN和大脑皮质的表达相位无明显作用;在外周,E2可延迟Per1 mRNA在肝肾的峰相位,并提高其峰值,但在子宫,E2对Per1和Per2 mRNA的表达有双向调节作用[62]。
生物钟在乳腺的表达也有一定特点,Per1和Bmal1在分化型HC11细胞中较高,Per2 mRNA水平则在未分化型细胞中明显升高;妊娠晚期及泌乳期Per1和Bmal1 mRNA在乳房组织中表达水平较高,Per2则在乳房发育期和妊娠早期表达水平较高。小鼠乳房上皮细胞(HC11)及乳房组织中,Per2的表达与原癌基因cMyc和细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)mRNA水平正相关,Per1和Bmal1的表达水平则与β酪蛋白mRNA水平有一定相关性。这些研究结果提示生物钟基因在乳腺发育及分化中具有重要作用[63]。
2.10 生物钟基因与免疫系统的关系
机体许多免疫应答参数,如细菌和病毒感染后血中各种免疫细胞的计数、细胞因子的水平等均有明显的昼夜节律,提示生物钟基因与免疫系统的功能有一定关系。
从大鼠脾脏提取了NK细胞,检测其生物钟基因(Per1、Per2、Bmal1、 Clock)表达,钟控基因 Dbp表达,与生物钟信号传导有关的 CREB 和溶细胞因子(粒酶B和穿素孔),以及细胞因子(IFNγ和TNFα)等的水平的昼夜节律[64];且利用RNA干扰技术,发现Per2基因敲除大鼠的NK细胞RNK16中,溶细胞因子水平明显降低[65]。这些结果提示生物钟基因对NK细胞功能的昼夜节律具有调节作用。
正常小鼠的外周粒性白细胞中Per1和Per2 mRNA的表达具有明显的昼夜节律,但Cry1/2双基因敲除的小鼠则丧失这种节律性。人白细胞中则有所差异,Per1 mRNA的表达具有明显的昼夜节律,而Per2和Bmal1 mRNA表达的昼夜节律则不明显[66]。Per2基因功能缺陷小鼠对抗脂多糖(LPS)诱导的内毒素性休克的作用更强;与野生型小鼠比较,LPS攻击后,Per2/小鼠血清中致炎(炎症前)细胞因子γ干扰素和白细胞介素1β水平明显降低,肿瘤坏死因子TNFα、IL6和IL10无明显变化,由此提示Per2对NK细胞功能具有重要的调节作用[67]。
此外,多种生物钟基因在外周血中单核细胞均有节律性表达[68],小鼠腹腔巨噬细胞中Bmal1蛋白水平具有明显的昼夜节律,Bmal1基因敲除小鼠中单核化学引诱蛋白1(MCP1/JE)水平降低,提示巨噬细胞的免疫功能受生物钟基因Bmal1的调节[69]。
2.11 生物钟基因与衰老及早老性痴呆等疾病的关系
衰老过程中,常常会出现昼夜节律紊乱的症状如睡眠障碍等,在早老性痴呆(Alzheimer's disease,AD),也有节律紊乱的情况存在。研究发现,衰老或AD患者的SCN内钟基因的表达节律及松果体分泌褪黑素的节律均出现紊乱,而且处于神经病理性损害I～Ⅱ期的AD患者,其节律也有一定程度的紊乱。AD患者CAN内褪黑素MT1受体数目明显减少[70],代偿性给予褪黑素或光照治疗,可减轻AD患者昼夜节律紊乱状况,改善睡眠。这些研究结果提示生物钟基因可能在衰老及早老性痴呆等疾病中具有重要作用[7172]。
2.12 生物钟基因与造血系统的关系
目前已知生物钟基因在体内定向造血干细胞和干细胞中均有所表达,有人观察了生物钟基因在骨髓和肝脏的表达情况,其中mPer2的表达在SP细胞、整个骨髓和肝脏均有明显的昼夜节律;mPer1和 mReverb alpha则只在骨髓和肝脏有表达,mBmal1则只在肝脏表达[73]。用定量RTPCR的方法检测发现,小鼠造血干细胞中6种生物钟基因mPer1、mPer2、 mBmal1、 mCry1、 mClock和mReverb alpha 的mRNA均有表达[74]。另外,有研究者定量RTPCR方法检测小鼠骨髓中mPer1和mPer2水平,结果发现24 h内二者在骨髓内的转录水平有明显的昼夜节律,且有双峰一谷的变化趋势[75]。由于芳香烃受体激动剂2,3,7,8四氯二苯二氧芑p二噁英(TCDD)可影响机体的昼夜节律,给予雌性C57BL/6小鼠连续5 d口服TCDD后,第6 d每4 h采集一次骨髓,用定量PCR检测骨髓中mPer1及 mPer2 mRNA,结果发现TCDD可影响mPer基因的转录过程[76]。
3 前景与展望
综上所述,近日节律基因除了对产生生物节律具有重要作用外,还广泛地影响着其他很多看似与近日节律无关的生命活动。然而,生物钟基因在大多数病理过程中的表达情况及其对病理过程的影响仍未完全被阐明;直到现在,对生物钟基因在许多疾病中的表达情况,以及在病理过程中的作用知之甚少。随着对生物钟基因研究的进一步深入,生物钟基因在疾病的发生、发展过程中所发挥作用的研究已经取得一定进展,这些研究结果将为我们防治疾病提供重要的理论依据。
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