点击显示 收起
【摘要】 目的 制备一种亲和树脂快速分离红血球凝集素。方法 通过甲状腺球蛋白和树脂的耦联来从红芸豆粗提液中快速分离红血球凝集素。结果 从红芸豆粗提液中快速地提取出了较纯的红血球凝集素,经SDSPAGE上显示亚基分子量为32 kD.并通过质谱确认为红血球凝集素,提取得到的凝集素使人红细胞50%凝集的蛋白质最低浓度为4 μg/ml左右。结论 成功制备亲和树脂并用于快速分离红血球凝集素。
【关键词】 凝集素;亲和树脂,红芸豆;分离纯化
【Abstract】 Objective To study a new method for purifying erythrohemagglutinin (PHAE) production from Phaseolus vulgaris by affinity resin.Methods Affinity resin was made by Sepharose CL 4B connecting with thyroglobulin,and it was used to purify PHAE from the excellent seeds of Phaseolus vulgaris. The final gel filtration chromatography,purity,molecular weight and isoelectric point of purified PHAE were determined by electrophoresis and mass spectrum.Results The purified PHAE showed single PAGE outline and had apparent subunit molecular weights of 32 kD by SDSpolyacrylamide gel electrophoresis(SDSPAGE). PHAE could promote agglutination of human erythrocytes evenat 4 μg/ml.Conclusion A rapid method for purifying PHAE production from Phaseolus vulgaris by affinity resin is established successfully.
【Key words】 erythrohemagglutinin; affinity resin; Phaseolus vulgaris; separation and purification
植物凝集素(Phytohemagglutinin,PHA)是豆科植物种子中富含的一种糖蛋白[1]。植物凝集素具有刺激外周血淋巴细胞RNA合成和有丝分裂,促进免疫反应,使细胞凝聚,肿瘤细胞失活以及诱发人外周血淋巴细胞产生抗癌淋巴因子等生物学活性[2]。文献[3]报道植物凝集素是由E、L两种亚基组成的四聚体蛋白质的混合物,按其亚基组成可分为L4,L3E,L2E2,LE3,E4五种同工凝集素,其中E4具有最强凝集红细胞的能力,本实验建立的通过亲和树脂方法纯化得到的凝集素主要是PHAE,它对糖链具有更加特异的识别能力。当前分离其方法很多,但大多较繁琐。本研究采用纯化的甲状腺,将其固定于树脂上作为配基,亲和层析纯化得到高纯度的凝集素,有较好的实用价值和应用前景。
1 材料与方法
1.1 仪器与试药
UV1102紫外-可见分光光度计(上海天美科技有限公司),高速冷冻离心机(Eppendorf公司),MINIPROTEIN Ⅳ电泳系统(BioRad公司)。
红芸豆(购自甘肃兰州),低分子量蛋白标准(上海东风生物技术有限公司),PHAE(Sigma公司),甲状腺球蛋白购买于Sigma公司,Sepharose CL 4B树脂,人红细胞悬液由本实验室自制,其它试剂均为国产分析纯。
1.2 甲状腺球蛋白亲和树脂的制备
参照文献方法[4],室温下将树脂溶胀。取1 ml Sepharose CL 4B树脂悬浊液于10 ml Ep管中,加入5 ml 5%高锰酸钾混匀,置于4℃冰箱中。静置过夜后用纯水冲洗树脂,收取黑色完好的树脂,按顺序通过水:丙酮体积比为4∶1,2∶1,1∶1,0∶1的溶液使被氧化的树脂置换到有机环境中。加入N羟基琥珀酰亚胺(NHS)粉末,使其终浓度为0.1 mol/L,摇匀后置于4℃冰箱8小时,并在这过程中间断的轻摇混合。然后再按照水:丙酮分别为0∶1,2∶1,4∶1,1∶0的溶液将树脂转换到无机环境,用磷酸缓冲液(0.02 mol/L,pH 8.0)洗3次在树脂沉淀后去掉上清再加入1 ml浓度为0.015 g/ml的甲状腺溶液,混匀后置于4℃冰箱8小时,用磷酸缓冲液(0.02 mol/L,pH 8.0)冲洗后便得到甲状腺球蛋白亲和树脂。
1.3 PHAE粗提液制备
称取红芸豆15 g,加入130 ml醋酸缓冲液(0.02 mol/L,pH 5.6),浸泡8个小时后匀浆。匀浆液低温搅拌过夜,用四层纱布过滤后离心(10 000 r/min,10 min),收集上清。稀盐酸调上清pH 5.6,4℃冰箱中放置30 min后离心(10 000 r/min,10 min),收集上清,按比例(27.7 g/100 ml)加入硫酸铵固体粉末,4℃冰箱中放置30 min后离心(10 000 r/min,10 min),收集上清透析除盐后即为红芸豆组织粗提液。
1.4 甲状腺球蛋白磷酸溶液配制
取0.030 g甲状腺溶于2 ml 0.02 mol/L pH 8.0的磷酸缓冲液中,制得甲状腺球蛋白磷酸溶液配制。
1.5 红芸豆中凝集素的分离纯化
将1.3中制得的凝集素粗提取液于1.2 制备得到的亲和树脂柱上样,用醋酸缓冲液(0.02 mol/L,pH 5.6)洗脱掉没结合的蛋白,离心去上清。用GlyHCl浸泡树脂4小时后,离心(1000 r/min,2 min),取上清用纯水透析后冻干,即得PHAE产品。
1.6 分析方法
1.6.1 蛋白含量的测定
参照文献[5],以牛血清白蛋白为标准,采用Lowery法分别测定红芸豆匀浆液,硫酸铵沉淀后上清液,透析液,洗脱峰蛋白质含量。
1.6.2 凝血活力测定
抽取人血1 ml加入抗凝剂,用生理盐水反复洗涤,离心(1500 r/min,10 min)最后收集红细胞溶于25 ml生理盐水中,制得人红细胞悬液。
参照文献方法[6,7],在微量V型血凝板上进行,用生理盐水倍比稀释凝集素,每孔含稀释液40 μl,加入2%人红细胞悬液40 μl,振荡混合,在25℃下放置1 h,肉眼观察结果,凝集活力以50%人红细胞凝集所需凝集素的μg数表示。
1.6.3 蛋白质亚基分子量测定
参照文献[8],使用不连续电泳(SDSPAGE),凝胶浓度为12%,pH 8.3,考马斯亮蓝R250染色。
2 结果与讨论
2.1 红芸豆中红细胞凝集素的分离纯化
经硫酸铵盐析除杂蛋白,透析除盐后即制得凝集素粗品。该粗品经甲状腺亲和树脂吸附后,用平衡液洗去未吸附的蛋白,换用洗脱液使凝集素与树脂分离。活力回收为48.4%,比活力提高了19.22倍(表1)。
2.2 PHAE的电泳检测
将粗提取液,硫酸铵盐沉淀后的上清以及沉淀,亲和洗脱峰进行SDSPAGE凝胶电泳,结果如图1.由图1中可知经甲状腺亲和树脂层析后的蛋白峰为单一条带,纯化效果较好。与分子量标准比较,亚基分子量在32 kD处,与预期一致,初步证明获得了纯的红细胞凝集素。
2.3 质谱验证
通过图2可以判断所得到的样品为纯的PHA。
2.4 凝血活力测定
将纯化得到的凝集素产品,在微量V型血凝板上进行凝血活力测定。当无凝集时血球沉于“V”型孔底部,呈一小圆点;凝集时血球相互聚集形成一片网络状,没有圆点出现。
实验中提取的凝集素起始浓度为2000 μg/ml,倍比稀释得到200~0.75 μg/ml浓度范围(1~10号孔)的样品,以生理盐水作为空白(11号孔),凝集素标准品为对照(起始浓度为200 μg/ml,凝血活力为8 μg/ml),测得凝集素的凝血活力为4 μg/ml.实验结果见图3和表2.表1 凝集素的纯化图2 质谱验证图3 提取凝集素样品(A)和凝集素标准品(B)凝血活力测定图表2 人红细胞凝集结果示意图 图1 A粗提液;B盐析上清;C盐析沉淀;D洗脱液;E小分量蛋白标准品
3 结论
红芸豆经浸泡,硫酸铵沉淀,透析,甲状腺亲和树脂层析,制得PHAE样品。样品经PAGE考马斯亮蓝R250染色后得到单一的带,SDSPAGE考马斯亮蓝染色显示亚基的分子量为32 kD,IEF电泳经考马斯亮蓝R250染色后测得样品的等电点为6.5,说明分离得到的红芸豆凝集素具有较高的纯度且与标准品一致。PHAE样品在血凝活性检测中,能使50%兔红细胞凝集的最低浓度约为4 μg/ml.目前纯化凝集素的方法主要包括传统纯化和亲和层析的方法。文献报道[2]可知PHA是由E、L两种亚基组成的四聚体蛋白质的混合物,按其亚基组成可分为L4、L3E、L2E2、LE3、E4五种同工凝集素。传统方法提取凝集素[2,3,911]的研究一般是先经硫酸铵沉淀将盐析后,通过各种凝集素单体的等电点不同,采用离子交换树脂结合来实现。离子交换子树脂法在前处理阶段需要盐析样品透析脱盐,处理量大,其操作繁琐耗时,产品凝血活力回收较低,产品质量较差。采用制备甲状腺亲和树脂操作简单,可多次使用使得成本低廉,而且产品活力和纯度较高,有较好的应用前景。
【参考文献】
[1] 丁邦裕,戴美红,余健.江苏菜豆同工凝集素的分离纯化及性质研究[J].生物化学杂志,1991,7(1):2527.
[2] 庄伟强.泰安市医疗废物特性研究及管理体系优化[D].济南:山东大学,2005:1415.
[3] 何涛,张涛,吴昌英,等.红芸豆红血球凝集素单体的分离纯化和性质研究[J].成都医学院学报,2008,3(2):107110,119.
[4] 王佳兴,苏志国,马光辉.生化分离介质的制备与应用[M].北京:化学工业出版社,2008:177.
[5] 杨建雄.生物化学与分子生物学实验技术教程[M].北京:科学出版社,2002:3435.
[6] Nitsan Z,Liener IE.Enzyme activities in the pancreas,digestive tract and feces of rats fed raw or heated soy flour[J].J Nutr,1976,106:300305.
[7] Jung WK,Park P J,Kim S K.Purification and characterization of a new lectin from the hard roe of skipjack tuna,Katsuwonus pelamis[J].Int J Biochem Cell Biol,2003,35:255265.
[8] 郭尧君.蛋白质电泳实验技术[M].北京:科学出版社,1999:54,123,161.
[9] 周红,曾仲奎,鲍锦库,等.油麻藤种子中凝集素的纯化及性的纯化与性质研究[J].中国生物化学与分子生物学报,1998,14(2):151155.
[10] 周长林,小田太雄,挂通一晃.藏红花凝集素分子化学修饰与其活性的关系[J].中国生物化学与分子生物学报,2003,19(1):8791.
[11] 李丹彤,崔铁军,马国庆,等.角叉菜凝集素的分离纯化及其性质[J].中国水产科学,2000,7(3):8084.