高山被孢霉Δ6脂肪酸脱氢酶基因转化大豆的研究

【摘要】  目的 从高山被孢霉中克隆的Δ6脂肪酸脱氢酶基因与植物表达载体pBA121连接,构建重组质粒pBMACL6,采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功地将该基因导入到栽培大豆吉林47品种中,获得一批转基因植株。方法 利用子叶节外植体诱导出丛生芽和再生植株,利用卡那霉素的抗性筛选培养基连续筛选以及PCR方法、DNA分子杂交分析检测转基因植株中的Δ6脂肪酸脱氢酶基因表达状况。结果 经PCR检测和DNA分子杂交分析,初步证明Δ6脂肪酸脱氢酶基因已导入并整合到大豆基因组中。结论 成功地将Δ6脂肪酸脱氢酶基因导入并整合到大豆基因组中。

【关键词】  Δ6脂肪酸脱氢酶基因;大豆;农杆菌介导转化;转基因植株

【Abstract】 Objective To introduce Δ6fatty acid desaturase genes from Mortieralla alpina into jilin47 via Agrobacterium infection method,adentitious,and obtain transgenic plants. Methods Adentitious buds and regenerated plants were induced from cotyledon nodes and screened continuously in kanamycin resistant culture medium. PCR and Southern blot were used to detect expression of the Δ6fatty acid desaturase genes in transgenic plants. Results PCR and Southern blot analysis from transgenic plants proved that the Δ6fatty acid desaturase genes were transferred and integrated into soybean genome. Conclusion The Δ6fatty acid desaturase genes are transferred and integrated into soybean genome successfully.

　　【Key words】 Δ6fatty acid desaturase gene; Soybean (Glycin max L); Agrobacteriummediated transformation; transgenic plant

　　脂肪酸脱氢酶(fatty acid desaturase)是不饱和脂肪酸合成途径的关键酶之一,能催化脂肪酸长链的特定位置上脱氢形成双键。在动物、植物和微生物等的膜脂中含有特定的不饱和脂肪酸,其不饱和程度由催化不同脱饱和反应的脱氢酶所调节[1]。因此,脂肪酸脱氢酶在生物膜的形成和物理性质、调节膜脂中脂肪酸的组成与不饱和度等方面起着决定性的作用[25]。

　　大豆中富含亚油酸,它可以作为Δ6脂肪酸脱氢酶作用的底物催化生成γ亚麻酸(GLA)。本室对不同来源的20多种大豆的脂肪酸成分的分析表明：亚油酸含量占脂肪酸总量的40%以上,最高达58.3%.现在,国内外报道的转基因大豆成功的例子很多,如抗除草剂、抗虫以及抗真菌等,转化方法也比较成熟。本室从高产γ亚麻酸的高山被孢霉菌株中克隆出Δ6脂肪酸脱氢酶的结构基因,是世界上第10个克隆出该基因的实验室,在GenBank中的序列接收号分别为AF307940,并在酵母和烟草中得到表达[69],为将该基因转化到大豆中提供了前提和基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　1.1.1 植物材料

　　吉林47优良品种,由吉林省农科院大豆研究所提供。

　　1.1.2 菌株与质粒

　　Mortierella alpina ATCC 16266,本室保存Agrobacterium tumefaciens LBA4404,由中科院微生物所方荣祥院士馈赠pGA643(Kanr),由内蒙古大学哈斯阿古拉教授惠赠pTMACL6(Ampr)(全长MA D6D cDNA),南开大学真菌实验室保存。

　　1.1.3 主要试剂

　　UNIQ10柱式多用途DNA纯化试剂盒,dNTP Mix,上游引物9651,下游引物w21500均购自上海Sangon公司;限制性内切酶,T4DNA连接酶,卡那霉素,利福平和链霉素等主要购自华美生物工程公司,宝生物公司;地高辛标记和检测试剂盒购自德国Roche公司;Taq DNA聚合酶,Taq DNA plus 购自鼎国生物技术有限公司;γ亚麻酸标准品购自Sigma公司;其余试剂均为国产分析纯。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 培养基的配制

　　LB、YEB培养基见《分子克隆实验指南》;MS及MSB配方见《分子克隆实验指南》。

　　1.2.2 抗生素与激素的配制

　　配制方法见《分子克隆实验指南》。

　　1.2.3 植物表达载体的构建

　　以重组质粒pTMACL6进行PCR,PCR的产物纯化后经XbaⅠ和BglⅡ双酶切获得高山被孢霉的Δ6脂肪酸脱氢酶基因,经与pGA643质粒载体连接构建出含有Δ6脂肪酸脱氢酶基因的pGMACL6表达载体。将该表达载体经电转化到LBA4404根癌农杆菌中,并以此菌进行东北大豆品种吉林47的转化实验。

　　1.2.4 农杆菌的培养

　　从保存的农杆菌平板上挑取含有表达载体的单菌落接入含有50 mg/L Kan、25 mg/L Rif、25 mg/L Str的YEB培养基中,28℃,150 r/min振荡培养。

　　1.2.5 农杆菌介导Δ6脂肪酸脱氢酶基因转化大豆。

　　1.2.6 转基因植株的分子生物学检测

　　转基因植株PCR检测 取卡那霉素筛选过的转基因植株,用CTAB法提取总DNA,用于PCR扩增Δ6脂肪酸脱氢酶基因。　　上游引物序列P1(9651)：5'GGCTTCTAGAATGGCTGCTGCTCCCAGT3'(XbaⅠ)下游引物序列P2(w21500)：5'CTGCAGATCTTTACTGCGCCTTACC3'(BglⅡ)反应条件：94℃ 5 min→94℃ 1 min→53℃ 1 min→72℃ 2 min→35 cycles→72℃ 10 min.转基因植株的Southern检测 大量提取PCR反应阳性大豆转基因植株的总DNA,HindⅢ单酶切后经过电泳及转膜步骤后与地高辛标记的Δ6脂肪酸脱氢酶基因的探针杂交,具体步骤见杂交试剂盒说明书。

　　2 结果

　　2.1 质粒DNA鉴定

　　对重组表达载体pGAMICL6进行XbaⅠ和BglⅡ双酶切鉴定,可见一条约1.37 kb的电泳带(Δ6脂肪酸脱氢酶基因约为1.37 kb),说明目的基因存在,结果见图1.图1 重组表达载体pGMACL6酶切鉴定

　　2.2 农杆菌的转化与鉴定

　　采用液氮冻融法将构建好的植物表达载体pGAMACL6转化到农杆菌LBA4404，然后再含有125 mg/LStr、25 mg/Lrif和100 mg/Lkan的YEB选择培养基上，28℃培养48 h后出现白色菌落。采用菌落PCR法鉴定农杆菌的转化子。电泳检测表明它们的PCR产物大小一致，均为1.37 kb，从而可以证明本试验构建的植物表达载体pGAMACL6已转入农杆菌中。PCR检测结果如图2.图2 PCR鉴定农杆菌中的D6D基因

　　2.3 农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化

　　在子叶节外植体获得后，转移到预培养基中培养24-36 h，然后进行农杆菌的感染。同时以未经预培养基培养和在预培养基培养140 h的子叶节诱导从生芽进行比较可知：未经预培养基培养的子叶节要比经过预培养24-36 h的子叶节推迟3-5 d左右出现从生芽。将子叶节预培养140 h，则子叶节诱导丛生芽率会急剧下降(如表1)。原因可能是短时间的预培养有助于切口细胞进入伤口修复反应，产生一定数量的愈伤，而长时间的在诱导愈伤培养基上预培养，阻碍了细胞进一步分化生长，并加快了细胞的老化及褐化过程，因而使诱导丛生芽率不断下降。表1 预处理对大豆丛生芽诱导的影响

　　2.4 转基因植株的分子生物学检测分析

　　2.4.1 转基因植株的PCR检测

　　以CTAB法提取大豆转化抗性再生苗(T0代)和T1代叶片中的总DNA，以材料和方法中的PCR反应条件进行扩增，电泳检测。结果在33棵吉林47抗性再生植株中，扩增出了约1.4 kb的目的带，而未转化的对照则无此目的带，PCR阳性率为65.12%.实际转化率为1.03%.见图3.

　　2.4.2 转基因植株的斑点杂交分析

　　提取PCR检测阳性的转基因植株叶片的总DNA，与Δ6-脂肪酸脱氢酶基因探针进行斑点杂交检测，结果PCR表现阳性的样品，在斑点杂交中均表现为阳性，杂交斑点清晰,见图4.图3 D6D基因转入大豆品种吉林47中的PCR鉴定图4 D6D基因转入吉林47中的Southern斑点杂交鉴定

　　3 讨论

　　3.1 影响农杆菌介导大豆遗传转化率的因子

　　3.1.1 无菌苗的培养时间

　　无菌苗的培养时间对于大豆子叶节的遗传转化也有很大影响。本实验分别采用培养2天、4天、6天和8天的无菌苗作为实验材料,切除其子叶节外植体经农杆菌感染后诱导转化芽,结果发现从培养4天的无菌苗上切除的子叶节外植体转化芽诱导率较高，这和构建再生体系时的结论一致。选择5天以上苗龄的子叶节表现为：抗性再生苗少,再生苗PCR阳性率较低,即获得的抗性植株嵌合体较多，可能是以这些苗龄的子叶节为外植体转化时,侧芽开始生长,而使再分化芽生长受到抑制,如将已长出的侧芽切掉,切口处则生成愈伤组织,但诱导丛生芽困难。

　　3.1.2 农杆菌菌株

　　农杆菌转化能力与农杆菌菌株[10]有关。王连铮等利用致癌农杆菌的15个菌系对2759个大豆品种的致癌作用进行了研究,筛选出7个致瘤能力较强的菌系,致瘤效果较好的菌株为B3 / 73、C58、A208.李洪泉等用根癌农杆菌chry5对我国10个大豆栽培品种子叶的致瘤作用进行了研究,结果对7个品种上致瘤率作用比我国的超毒菌株A281还强,对所有品种的致瘤率高于T37,说明不同农杆菌菌株转化能力差异很大。本实验采用根癌农杆菌LBA4404,该菌株广泛应用于大豆的遗传转化中。根癌农杆菌通常用YEB培养液活化后,再感染外植体。农杆菌活化时间以及感染时农杆菌的菌农对转化率都有一定的影响，一般而言,农杆菌在活化30小时左右为最佳感染时间,此时农杆菌的感染能力最强。

　　3.1.3 感染时间

　　本实验主要采用浸泡的方法来感染外植体,实验结果表明：感染时间以15～20分钟为宜,时间较短会使转化率降低,而时间过长会使外植体易黄化或褐化,影响芽的诱导。另外,实验还发现感染时人为制造伤口的转化效果优于未造成伤口的转化效果。

　　3.1.4 酚类化合物AS

　　酚类化合物乙酰丁香酮(AS)等对农杆菌转化能力有明显影响。国外Annette等报道乙酰丁香酮利于提高大豆的转化效率,国内许跃和李宝键实验也证明,多酚化合物或用对农杆菌敏感的植物提取物处理农杆菌,诱导Vir区基因活化,增加农杆菌在培养植物细胞上的附着[11,12]。本实验也表明：农杆菌感染后共培养时加入100 suM/L的乙酰丁香酮对农杆菌转化能力有明显的提高,促进根癌农杆菌对外植体的高效转化。

　　3.2 影响抗性再生苗生根的因子

　　3.2.1 转化苗的生长情况

　　转化苗在加有GA3的伸长培养基中培养一段时间后转移到生根培养基中,实验表明,当转化苗在伸长培养基中长到3～4 cm长时转到生根培养基中最利于生根。过矮会使抗性苗在生根培养基中生长缓慢,以造成抗性苗的矮化;过高会使抗性苗易老化,在生根之前就死亡。

　　3.2.2 抗生素及激素

　　本实验的生根培养基中已去除了抑制细菌的头孢霉素,抗性压力也有所缓解,卡那霉素由分化培养基中的50 mg/L降为25 mg/L.对于激素而言,不加6苄氨基嘌呤(6BA),3吲哚丁酸(IBA)由0.2 mg/L升高到1.5 mg/L.

　　3.2.3 蛭石和生根粉

　　抗性再生苗在生根培养基中长出主根后,转入蛭石中。由于蛭石良好的透气性,有利于主根的生长和大量侧根的形成。另外,使用生根粉利于根的生长。

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