临床分离表皮葡萄球菌生物膜形成与其耐药性的相关性分析

【摘要】  目的 分析临床分离的表皮葡萄球菌对抗菌药物的耐药性与生物膜形成能力的关系。方法 收集成都地区两家医院非重复临床分离表皮葡萄球菌45株,用半定量黏附实验检测其生物膜形成能力,采用KB法以统一方案进行抗菌药物药敏试验,按CLSI2009版判断结果,用χ2检验分析表皮葡萄球菌耐药性与生物膜形成能力之间的关系。结果 45株表皮葡萄球菌中18株为生物膜形成株,其中12株来源于分泌物标本,6株来源于其他无菌体液。来源于分泌物和其他无菌体液的表皮葡萄球菌生物膜形成能力差异无统计学意义(P>0.05);45株表皮葡萄球菌除对万古霉素、利奈唑胺、喹奴普丁/达福普丁有较高的抗菌活性外,对青霉素、氨苄西林/克拉维酸、苯唑西林、头孢唑啉、复方新诺明、林可霉素、环丙沙星、红霉素、庆大霉素、亚胺培南的耐药率均>50%,特别是苯唑西林耐药表皮葡萄球菌(MRS)高达88.9%.可形成生物膜和不可形成生物膜的菌株对抗菌药物耐药率差异无统计学意义(P>0.05)。结论 表皮葡萄球菌对抗菌药物的耐药性与其生物膜形成能力无相关性。

【关键词】  表皮葡萄球菌;生物膜;细菌耐药性

　Abstract:Objective To analyze the correlation between biofilm forming ability and drug resistance of Staphylococcus epidermidis clinical isolates.Methods The biofilm phenotype of 45 strains was detected by semiquantitative adherence assay.The antimicrobial susceptibility was tested according to an agreed protocol using KB method.Results were analyzed according to CLSI criteria 2009.The correlation of antibiotic resistance and biofilm formation was analyzed by χ2 test.Results Biofilm phenotype was identified in 18 strains of Staphylococcus epidermidis.Among 18 strains,12 strains were from secretion and 6 strains were from abacterial body fluid.The ability of biofilm formation in strains from secretion and abacterial body fluid was not statistically different(P>0.05).Vancomycin,linezolid and quinupristin/ dalfopristin were still highly active against 45 strains.More than 50% of Staphylococcus epidermidis isolates were resistant to penicillin,ampicillinclavalanic acid,oxacillin,cefazolin,compound sulfamethoxazole,lincomycin,ciprofloxacin,erythromycin,gentamycin and imipenem,especially MRS in Staphylococcus epidermidis was 88.9%.The different resistance rates of strains between biofilm formation and biofilm unproduction were not statistically significant(P>0.05).Conclusion No correlation is found between biofilm formation and antibiotic resistance in these isolates by statistical analysis.

　　Key words:Staphylococcus epidermidis;biofilim;drugresistance

　　生物膜的形成是细菌为适应自然环境而采取的一种策略。生物膜对抗抗生素和机体免疫吞噬作用的特征是生物材料相关感染性疾病的重要原因。随着生物材料(人工瓣膜、人工关节、静脉插管等)在临床的广泛应用,表皮葡萄球菌引起的临床感染日益增多[1]。虽然体外实验显示感染细菌对抗生素敏感,但在体内却难以清除。生物膜状态下的细菌相对其浮游状态具有显著增强的耐药性,因此,分析临床分离的表皮葡萄球菌生物膜形成能力与抗生素耐药性的相关性,对指导临床有效控制表皮葡萄球菌引起的感染具有重要意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 菌株来源和鉴定

　　收集成都地区两家医院患者临床标本中分离的45株表皮葡萄球菌,删除同一患者相同感染部位分离的重复分离菌株。采用MicroScan WalkAway 96SI全自动微生物鉴定及配套Positive Combo Panel Type 20(PC31测试板)进行细菌鉴定。以表皮葡萄球菌ATCC 12228株为生物膜形成的阴性对照株。

　　1.2 主要试剂及仪器

　　LB肉汤(胰蛋白胨10 g/L、酵母提取粉5 g/L、氯化钠10 g/L、葡萄糖0.25 g/L)购自杭州微生物试剂有限公司,MH培养基及受试的药敏纸片均购自英国Oxoid公司。

　　1.3 方法

　　1.3.1 药敏试验

　　药敏试验采用美国临床实验室标准化研究所(CLSI)推荐KB法药敏试验,按《全国临床检验操作规程》(第三版)进行,根据CLSI 2009版判定结果。

　　1.3.2 表皮葡萄球菌生物膜形成能力检测

　　采用传统的半定量黏附实验检测表皮葡萄球菌生物膜形成[2],将LB肉汤培养18h的表皮葡萄球菌用新鲜LB肉汤(0.25%葡萄糖)按1∶200比例稀释。将0.2 ml稀释后的菌液加入96孔平底组织培养盘,每株分别移入4个平行孔。在37℃培养18 h后,用移液器吸头吸干每孔菌液,然后用PBS(pH7.2)缓冲液洗板3次,然后用BOUIN固定液固定,用结晶紫染色,洗去未黏附细菌,晾干,每孔加入200 μl丙酮酒精,微振荡,酶标仪检测每孔的A570 nm值。生物膜形成阳性株筛选条件为:阴性对照菌株平均A值+3倍标准差为界定值,以平均A值大于界定值为生物膜形成阳性株。

　　1.3.3 统计学处理

　　用四格表χ2检验分析耐药表皮葡萄球菌与形成生物膜的关系。

　　2 结果

　　2.1 表皮葡萄球菌生物膜形成能力检测

　　在半定量黏附实验中测得界定值为0.110,根据生物膜形成株的筛选条件,45株表皮葡萄球菌中18株为生物膜形成株,占40%,27株为不可形成生物膜菌株。

　　2.2 标本来源与生物膜形成株的临床分布

　　临床分离45株表皮葡萄球菌中,标本来源以分泌物为主,共33株,占73.3%;血液或骨髓标本共5株,占11.1%;腹水和脑脊液标本各2株,占4.4%;尿液、透析液、穿刺液标本各1株,占2.2%.来源于分泌物和其他无菌体液(血液、骨髓、腹水、脑脊液,尿液、透析液和穿刺液)的表皮葡萄球菌生物膜形成能力差异无统计学意义(χ2=0.232,P>0.05)。结果见表1。表1 标本来源与生物膜形成菌株的临床分布

　　2.3 表皮葡萄球菌对17种抗菌药物的耐药率

　　45株表皮葡萄球菌除对万古霉素、利奈唑胺、喹奴普丁/达福普丁有较高的抗菌活性外,对青霉素、氨苄西林/克拉维酸、苯唑西林、头孢唑啉、复方新诺明、林可霉素、环丙沙星、红霉素、庆大霉素、亚胺培南的耐药率均>50%,特别是苯唑西林耐药表皮葡萄球菌高达88.9%(40/45)。可形成生物膜和不可形成生物膜的菌株对抗菌药物耐药率(见表2)。

　　2.4 耐药表皮葡萄球菌与生物膜形成的关系

　　对可形成生物膜和不可形成生物膜的表皮葡萄球菌对17种抗菌药物耐药率进行分析,其耐药性差异无统计学意义(P>0.05)。表2 可形成与不可形成生物膜的表皮葡萄球菌对17种抗菌药物的耐药率

　　3 讨论

　　表皮葡萄球菌是存在于人体皮肤表面的正常菌群,通常为无毒力或低毒力,并不致病。但近年来随着透析技术、人工心脏瓣膜、人工关节、人工血管和各种支架等医疗材料的应用,表皮葡萄球菌对医用生物材料的感染能力较之人体组织大大增强,并通过黏附形成生物膜,造成慢性反复性感染。对于临床微生物实验室而言,表皮葡萄球菌生物膜形成株的诊断的意义重大。半定量黏附实验为细菌生物膜表型检测的传统经典方法,本研究通过半定量黏附实验测得临床分离的45株表皮葡萄球菌中18株(占40%)具有生物膜形成能力,其中12株来源于分泌物标本,6株来源于其他无菌体液。来源于分泌物和其他无菌体液的表皮葡萄球菌生物膜形成能力差异无统计学意义(P>0.05),意味着表皮葡萄球菌生物膜形成无组织器官的选择性,无论标本来源如何,表皮葡萄球菌相关感染都要重视其生物膜形成能力。

　　本次实验所用的45株表皮葡萄球菌全部来自住院病人,除对万古霉素、利奈唑胺、奎奴普丁/达夫普丁有较高抗菌活性外,对青霉素、氨苄西林/克拉维酸、苯唑西林、头孢唑啉、复方新诺明、林可霉素、环丙沙星、红霉素、亚胺培南、庆大霉素耐药率均>50%,特别是对苯唑西林耐药的表皮葡萄球菌(MRS)高达88.9%(40/45),而细菌一旦为MRS,本身则具有多重耐药性,包括对β内酰胺类、喹诺酮类、氨基糖苷类等临床常用抗生素都会产生耐药。如此高的耐药率表明本次分离的表皮葡萄球菌可能与医院感染的关系密切,应进一步追踪其流行病学及耐药机制。

　　国内外一些研究[36]指出,生物膜状态下的细菌相对其浮游状态具有显著增强的耐药性,其机制主要为:①抗菌药物渗透障碍。生物膜内细菌密度高,并有大量胞外基质包裹,抗菌药物的扩散速度减慢,无法以有效浓度渗透至深部细菌之中,从而使药物难以发挥其杀菌作用。②由于营养与氧气的限制,生物膜内细菌的代谢率降低,抗菌药物通过作用于代谢环节去影响细菌活性的概率也降低。③生物膜内细菌特殊的基因表达方式可使耐药基因表达增加。本次实验中,可形成生物膜的菌株对受试的17种抗菌药物的耐药率均高于不可形成生物膜的菌株,但此耐药率的差异却无统计学意义(P>0.05),提示常规药敏实验显示的细菌浮游状态的耐药性与其是否能形成生物膜并无相关性。这一结果与本次试验有88.9%菌株为具有多重耐药性的MRS有关,也与孙凤军等[7]的报道相似。Melchior MB等[8]的研究也证实:与浮游细菌相比,生物膜细菌对抗菌药物的抗药性虽可提高101000倍,但主要表现在抗菌药物MBC降低,MIC并无明显影响,而MIC是目前CLSI体外药敏实验敏感与耐药的判断标准。因此,仅仅针对浮游状态的细菌所做的常规药敏实验,并不能真实评估抗菌药物对生物膜细菌的耐药性。实际上大多数菌株所形成的生物膜仅能在一些抗菌药物相当高的浓度下被清除,而该浓度远远超出抗菌药物在体内所能达到的极限值,因此,在临床上判断抗菌药物治疗效果应依据实际造成感染的细菌状态来确定,而生物膜形成能力与耐药性的关系,也还需要大样本的、广泛的深入研究,才能得到客观、准确的评价。

【参考文献】
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