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【摘要】 目的 探讨嗅鞘细胞移植脊髓挫伤大鼠后,在其神经损伤及修复过程中三种神经营养因子(脑源性神经营养因子、神经生长因子、睫状神经营养因子)的表达变化及意义。方法 体外分离培养大鼠嗅球嗅鞘细胞。40只健康SD大鼠,雌雄不拘,在移植前一星期使用NYU撞击机,利用10g25 mm的致伤力,制作T10脊髓挫伤模型。40只脊髓挫伤大鼠随机分为OECs移植组和对照组(注射无血清培养液组),又根据取材时间不同分为术后1天、7天、14天、21天组。动物处死前进行BBB评分评估后肢运动功能的变化。取手术部位头端和尾端0.5cm脊髓,采用免疫组织细胞化学染色检测技术检测三种神经营养因子(BDNF、CNTF、NGF)在各组脊髓中的表达变化。结果 行为学评分随着损伤时间的推移呈小幅度增加,但后肢无运动功能恢复;免疫组织化学检测显示,嗅鞘细胞移植能部分改善大鼠脊髓灰质神经细胞的凋亡程度,延缓白质神经纤维的减少,促进髓鞘的修复与再生。与对照组比较,嗅鞘细胞移植治疗后脊髓组织中三种神经营养因子表达明显增加(P<0.05)。结论 嗅鞘移植能够部分改善脊髓损伤后脊髓组织的病理形态,促进脊髓组织中多种神经营养因子的表达。
【关键词】 OECs;移植;神经营养因子
Abstract:Objective To investigate the expression of three neurotrophic factors(brainderived neurotrophic factor,ciliary neurotrophic factor,nerve growth factor)in rats with spinal cord contusion following olfactory ensheathing cell transplantation.Methods The OECs were dissociated from the olfactory bulbs of the adult GFP rat,primarily cultured.Forty clean adult Sprague Dawley(SD)rats were randomly divided into OECs transplantation group and control group(DMEM transplantation),two groups were subdivided into four groups,with the rats sacrificed 1,7,14 and 21 days after the operations(day of postoperation,DPO),respectively.The spinal cords of all the rats were completely contused at T10 by NYU with 10g～25 mm.The Basso,Beattie and Bresnahan locomotor testing scales(BBB scores)were used to evaluate the locomotor function of hindlimbs of the rats.The expressions of three neurotrophic factors in the spinal cords were detected with immunohistochemistry technique.Results The BBB scores increased gradually with the time after the spinal cord injury.But the hindlimb locomotor function did not improve significantly.Immunohistochemistry result showed that OECs transplantation could partly reduce the number of apoptosis cells in spinal gray matter,delay cells reduction in spinal white matter,and accelerate the medullary sheath repair and regeneration.The expression of three neurotrophic factors(BDNF、CNTF、NGF)in spinal cord tissue after transplantation were obvious increased than that of DMEM/Ham’s F12 group(P<0.01).Conclusion OECs transplantation can partly improve the pathology morphous of injured spinal cord,facilitate the expression of three neurotrophic factors.
Key words:OECs;transplantation;neurotrophic factors
嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)位于嗅觉中枢和周围神经系统的过渡区,兼有中枢神经系统星形胶质细胞和周围神经系统雪旺氏细胞的特点[1,2],在嗅神经轴突生长发育过程中发挥重要作用;同时,因其能够促进多种中枢神经系统神经元存活和轴突生长[35],对中枢神经系统损伤的修复作用日益受到广泛关注。目前认为,嗅鞘细胞促进神经元存活和轴突生长的功能部分源于嗅鞘细胞分泌的多种营养因子和支持因子[6],如神经生长因子(nerve growth factor,NGF),脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophicfactor,BDNF),胶质源性神经营养因子(glial cell line derived neurotrophic factor,GDNF)等。BDNF、CNTF、NGF作为神经系统三种最重要的生物活性因子,它们不仅能促进神经元的生长、发育、分化,而且具有神经保护作用,在神经损伤修复过程中发挥重要作用[7]。本实验经原代培养纯度较高的GFP嗅鞘细胞,然后将其移植入T10挫伤大鼠脊髓;再采用免疫组织细胞化学方法对大鼠脊髓挫伤后不同时间点几种神经营养因子在脊髓中的表达变化进行分析,并观察动物行为学的改变,探讨其在SCI修复过程中的作用,以期为临床治疗用药和治疗时机提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物、 主要试剂和仪器
清洁级成年SD大鼠40 只,雌雄不拘,体质量(290±25)g.我院所实验动物中心提供。SP免疫组化试剂盒( 北京中杉金桥);DAB染色剂(北京中杉金桥);显微镜(日本奥林巴斯)。
1.2 嗅鞘细胞纯化培养及纯度鉴定
按照张洁元等[8]的方法进行。无菌条件下取2.5月龄的GFP大鼠嗅球最外两层,经分散后将细胞种植于含20%胎牛血清的DMEM /F12培养基中。采用差速贴壁和阿糖胞苷抑制相结合的方法培养。在培养第14天行S100 和神经生长因子受体(NGFRp75)的免疫细胞化学染色鉴定,并计算嗅鞘细胞的纯度。
1.3 大鼠脊髓挫伤模型的建立及嗅鞘细胞移植
实验大鼠用ketamine/xylazine(90/4mg/kg,i.p.)麻醉后,背部脱毛、消毒,逐层切开皮肤和肌肉,暴露T10椎板,然后予以咬除显示脊髓,彻底止血后使用NYU撞击机,利用10g25 mm的致伤力,制作T10脊髓损伤模型。动物随机分为两组,每组20只。移植组(注射细胞组 ):损伤后在立体定位仪下用微量加样器(Hamilton)连接的玻璃针立即将准备好的细胞悬液注射到挫伤处头、尾两侧1.0 mm、距中线0.5 mm处。注射深度分别为1.75,1.25和 0.75mm,每点在约3060 s内注射1.5μl,另在横断处注射2处,注射深度为1.25 mm,每处1.5μl,共注射7.5μl.对照组(注射无血清培养液组 ):方法同移植组。
1.4 行为学测试
采用BBB评分体系[9]。实验动物按照组别在术后 1 d、7 d、14 d、21d 测定。观察前排空膀胱,以免影响大鼠活动,而后将动物置于平坦不滑的实验台上,观察 4 min,对动物的躯体定位及后肢功能进行行为学评分。小于4分为无运动功能恢复,正常运动功能为21 分,评分者为熟悉评分标准的非本组实验人员,3人评分后取平均值。观察时间根据大鼠的活动习性定在20：00 左右。
1.5 标本处理和免疫组织细胞化学染色检测
1.5.1 取材
大鼠麻醉后俯卧固定,切开背部皮肤和脊柱两侧肌肉,咬骨钳咬开椎板,充分暴露脊髓,眼科剪剪取手术部位头端0.5,尾端0.5cm,装入1.5ml EP管,投入液氮中速冻,后转移到70℃冰箱保存。
1.5.2 运用免疫组织化学法观察各组脊髓组织中几种神经营养因子的表达与分布
取出冰冻切片,风干。 新鲜0.3%H2O2室温10min 以灭活内源性酶。PBS浸泡3×3 min. Proteinase K 200∶1消化切片30 min.PBS浸泡3×3 min.滴加5%BSA封闭液,室温 20 min.甩去多余液体,不洗。加NGF或 BDNF或CNTF 一抗(稀释度1∶200)置湿盒中,37 ℃,30 min.PBS 浸泡 3×3 min,滴加生物素二抗,置湿盒中,37 ℃,10 min.PBS浸泡3×3 min,滴加SABC,置湿盒中,37℃,20 min.PBS 浸泡3×3 min,DAB显色。苏木精轻度复染,脱水,透明,封固。用 Zeiss荧光显微镜观察照相,每张切片取损伤边缘头侧、 尾侧和对侧 3个视野拍照。10×10放大倍数下每张照片实际面积为1.44 mm2;10 ×20倍数下为0.40 mm2。面积测量借助显微目镜测量尺进行。
1.6 实验数据分析
图片采用Image Pro 5.0系统做图像分析,所得各组数据用±s表示;细胞移植组与对照组的数据比较用分组 t检验,统计分析软件采用SPSS13.0,数据导入 origin75作图。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 脊髓挫伤后不同时间的行为学测试结果
各组与正常组评分比较差异显著(P<0.01),说明造模后大鼠的神经功能均受到损害。随着时间的推移,OECs组大鼠的BBB 评分缓慢提高,但评分值提高不大,到第三周(21天)尚未达到运动功能的恢复,但嗅鞘细胞组与模型组、DF12培养液组相比差异显著(P<0.05),说明造模后采取措施有助于神经功能的恢复(见图1)。
2.2 脊髓挫伤后三种神经营养因子的表达变化
三种神经营养因子经免疫组化染色后阳性呈棕黄色,神经元阳性染色见于细胞浆或边聚于细胞膜内侧,胶质细胞则分布在细胞核中,神经纤维阳染均匀分布在整个纤维中,成片状。正常组脊髓灰、白质均有极少量神经营养因子表达,散见于整个横截面,以灰质稍多见,阳性染色多分布于纤维上,纤维排列整齐,可见少数几个星型细胞染色。OECs移植后三种神经营养因子表达大量增加,脊髓挫伤处的周边组织均可见三种营养因子表达。移植组三种营养因子的表达都明显高于对照组(P<0.05),且OECs移植后21天三种神经营养因子的表达都还明显高于对照组(见图 2)。正常对照组(BDNF) DMEM移植组21天(BDNF) OECs移植组21天(BDNF)正常对照组(CNTF) DMEM移植组21天(CNTF) OECs移植组21天(CNTF)正常对照组(NGF) DMEM移植组21天(NGF) OECs移植组21天(NGF)图2 各组脊髓组织三种神经营养因子免疫组化(×400)图1 各组脊髓功能CBS 评分
3 讨论
脊髓挫伤是研究脊髓损伤修复的重要模型之一,我们所采取的模型制作方法,术后脊髓有明显的血肿,术后8 d行为学测试肢体无功能恢复,挫伤明显,效果可靠。从 BBB 评分的数据上我们可以看出随着时间的推移,评分增加,这一过程中微环境中的各种营养因子可能起到了重要的作用,实验证据也表明给予营养因子的治疗后,大鼠的运动功能会有所改善[10]。未给予治疗的脊髓挫伤大鼠术后两周BBB评分仍然没有达到4分,后肢功能仍未恢复,这说明微环境中既有损伤修复的促进因素也有抑制因素,因此深入研究损伤后各因子的变化和作用有着重要的意义。
OEC移植入成年大鼠的脊髓损伤处能促进功能的恢复和轴突的再生,形态学观察到它们桥接在损伤导致的空洞处,促进轴突穿过病变区,并且形成髓鞘围绕再生的或脱髓鞘的轴突,来增强轴突的传导性[11],但其作用机制还不清楚,推测嗅鞘细胞能合成某些特殊的细胞外基质和营养因子来支持轴突的黏附和生长。
很多神经营养因子已被报道在脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后对神经有保护作用。CNTF mRNA在脊髓半横断损伤后 13天增加,然后在 1014天后降低[12]。另外,Lee等[13]发现脊髓半横断后,CNTF在术后 7天达到最大值,然后在14天降低到基线水平。脊髓损伤后,FGF2最早在 6 h内增加,在 7天后还很明显。增加的 FGF2主要局限在损伤的中心部位,7天后仅仅在损伤位置的头侧端可见。这些营养因子的持续表达可能对组织的修复有很重要的作用。但是嗅鞘细胞移植后对脊髓组织的神经营养因子表达影响的研究报道较少。在本实验中,我们观察到嗅鞘细胞移植后,脊髓内这三种因子的表达增强,尤其在移植 21天后表达还明显高于对照组。一方面,移植的嗅鞘细胞在体内表达BDNF、CNTF及NGF;另一方面,OECs移植后,脊髓本身组织表达的这三种营养因子也增强。这三种营养因子在脊髓的表达增强可能对脊髓的神经元、少突胶质细胞以及星型胶质起了重要的保护作用。
【参考文献】
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