OMgp及其受体NgR在大鼠中枢神经系统发育中的表达

【摘要】  目的 探讨再生抑制相关蛋白OMgp及其受体NgR在中枢神经系统发育中的表达规律及其意义。方法 SD大鼠按不同发育阶段(E20,2、6、10 w,1 y)取材,用RTPCR、免疫组织化学方法检测OMgp和NgR在海马、脑干、脊髓部位的表达情况。结果 RTPCR结果显示,OMgp的表达从E20开始逐渐升高,6 w达到最高峰,之后逐渐下降直到1 y;NgR在E20开始有微弱的表达,之后逐渐升高。免疫组织化学结果显示,NgR在E20无表达,但从2～10 w表达逐渐增强,并且10 w时可见其在脊髓白质少突胶质细胞表达。结论 OMgp在中枢神经系统发育中可能是作为一种正常环境因子参与轴突生长、突触联系的调节以及少突胶质细胞和神经元轴突间的识别,NgR也可能具有与轴突再生抑制无关的其他功能。

【关键词】  OMgp;NgR;中枢神经系统;发育;髓鞘

　【Abstract】 Objective To explore the expression of oligodendrocyte myelin glycoprotein(OMgp)and its receptor NgR during the development of central nervous system.Methods RTPCR and immunohistochemistry were performed to detect the expression of OMgp and NgR in the hippocampus,brainstem and spinal cord from E20,2,6,10weeks and 1year old rats.Results RTPCR results indicated that the expression of OMgp increased gradually from E20 to 6 weeks and decreased from 6 weeks to 1 year(the longest time detected).The expression of NgR was weak at E20 and increased after then.Immunohistochemistry results indicated that although the expression of NgR was not detected at E20,it increased gradually from 2 to 10weeks and could be detected in oligodendrocytes in the white matter of spinal cord at 10weeks.Conclusion OMgp may be one of the normal environment factors that regulate the axonal outgrowth and synaptic connection and recognition between oligodendrocytes and neurons.NgR could have functions other than inhibiting axonal regeneration.

　　【Key words】 OMgp;NgR;CNS;Development;Myelin

　　少突胶质细胞髓鞘糖蛋白(oligodendrocytemyelin glycoprotein,OMgp)是继MAG、NogoA之后发现的第三种CNS髓鞘抑制蛋白,它与MAG、NogoA一样,通过与三者共同的受体NgR结合来发挥抑制轴突再生的作用。出生后OMgp在CNS发育中的表达已有研究报道[1,2],但是胚胎期OMgp在CNS的表达情况目前并不清楚,发育中CNS所表达的OMgp和成年后表达的OMgp相比可能具有不同的功能,正如Nogo在CNS发育中的功能可能就和成熟后不同一样[3,4]。因此研究胚胎期OMgp的表达情况将有助于进一步研究OMgp在CNS发育中的功能。

　　NgR是三种髓鞘抑制蛋白共同的受体,并且三者对NgR活性结合位点具有竞争作用,可见NgR在轴突再生抑制信号的传导通路中起着枢纽作用,因此在CNS损伤与再生的研究中受到广泛的重视。NgR除了广泛表达于CNS的多种神经元[5],在少突胶质细胞等非神经元细胞类型中也有NgR的表达[6],提示NgR除了介导髓鞘抑制蛋白的抑制信号,可能还有其它功能。研究CNS发育中NgR在神经元和少突胶质细胞中的表达变化规律将为深入探讨NgR的其它功能打下基础。

　　本研究通过对OMgp及其受体NgR在CNS发育中的表达进行检测,旨在探讨这两种再生抑制相关蛋白在CNS发育中的表达规律及其意义。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物与分组

　　健康SD大鼠,除胎鼠雌雄不限外,其余均为雌鼠,由第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供。动物分组如下:(1)OMgp组:按胚胎期第20天(E20)、出生后2周(2w)、6周(6w)、10周(10w)、1年(1y)5个时间段取材(n=10),取海马、脑干、脊髓,用于RTPCR;(2)NgR组:按E20，2、10 w三个时间段取材(n=10),取海马、脑干、脊髓,用于RTPCR;取全脑作冠状面切片,取脊髓作横切,片厚25 μm,用于免疫组织化学染色。

　　1.2 RTPCR

　　Trizol(Invitrogen)提取总RNA,按RTPCR试剂盒(TAKARA,DRR019A)使用说明进行RTPCR,内参为βactin。引物序列如下:OMgp:上游引物5'GCCTTCCAAACTACATAT3,下游引物5'AGTGGTGTCTTTGCTTAG3';NgR: 5'CAGCTCTGCAGTACCTCTAC3',5'CTCTAAGTCACTGGTAGCCAG3';βactin:上游引物5'GGGACCTGACAGACTACCTC3',下游引物5'GATGCCACAGGATTCCAT3'。 RTPCR产物于1%琼脂糖凝胶中电泳后,在凝胶成像分析系统上观察照相并分析处理凝胶,产物量以积分光密度(IOD)×面积表示,以OMgp/NgR mRNA RTPCR产物与内参βactin产物的比值代表OMgp/NgR mRNA表达的相对水平。

　　1.3 免疫组织化学染色

　　免疫组织化学染色按之前所述方法进行[7]。一抗为小鼠抗OMgp(1∶200,Serotec),兔抗NgR(1∶200,R&D)。对照组一抗用正常山羊血清或磷酸盐缓冲液(PBS)代替。硫酸镍按增强法显色。

　　1.4 统计学处理

　　RTPCR实验数据用均数±标准差(±s)表示,用t检验比较均数间相差的显著性,以P<0.05表示差异有统计学意义,以P<0.01表示差异有显著性统计学意义。免疫组化实验每组取5张切片,用Image Pro.5.0进行图像分析,以IOD代表免疫反应强度,并计算阳性细胞数量。

　　2 结果

　　2.1 CNS发育中OMgp的表达

　　RTPCR结果显示,E20～6 w,海马、脑干、脊髓的OMgp mRNA的表达逐渐升高,6 w达到最高峰,之后逐渐下降,在海马和脊髓一直下降到1 y,而在脑干10 w后已无显著变化(图1A～1C，1G)。

　　2.2 CNS发育中NgR的表达

　　RTPCR结果显示,E20时海马、脑干、脊髓部位已有较弱的NgR mRNA表达,之后逐渐增强(图1D～1F，1H)。但免疫组织化学实验中,E20时CNS各部位并未检测到NgR的表达。2 w时CNS各部位神经元呈现较弱的NgR免疫反应阳性,阳性物质为淡蓝紫色,高倍镜下显示免疫反应阳性物质主要集中于细胞浆,另外,皮层、海马的部分神经元突起也可见染色,而细胞核则均为阴性。阳性细胞数量较少,主要分布于扣带后皮质、海马CA2和CA3区(图2 A)、脑干中缝隐核以及脊髓前角。10 w时CNS各部位神经元呈现很强的NgR免疫反应阳性,阳性物质为深紫色,高倍镜下显示免疫反应阳性物质大量集中于神经元细胞浆及突起,细胞核为阴性,阳性细胞数量多,主要分布于扣带后皮质、下丘脑室周核、丘脑内侧背核、丘脑外侧背核、丘脑后核、海马CA2和CA3区(CA1和CA4区阳性细胞数量相对较少)(图2B、2C、2C')、脑干三叉神经脊束核、小细胞网状核、脊髓前角运动神经元(后角阳性细胞数量相对较少),而脊髓白质的少突胶质细胞也出现了很强的免疫反应阳性,胞体呈多角形,突起少而长,主要分布于薄束、楔束、皮质脊髓前束、皮质脊髓侧束、顶盖脊髓束、前庭脊髓束等区域(图2D)。CNS发育中神经元NgR免疫反应性的相对强度见表1 。表1 CNS发育中神经元NgR免疫反应性

　　3 讨论

　　OMgp是一个相对分子质量为120×103的糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白,1988年由Mikol和Stefansson鉴定并命名,2002年Kevin等[8]和Vicky等[9]分别发现OMgp具有抑制轴突再生的作用,成为继MAG,NogoA之后发现的第三种髓鞘源性抑制蛋白。虽然啮齿类动物出生后CNS OMgp mRNA的表达已有研究[1,2],但胚胎发育时期CNS OMgp mRNA的表达情况国内外目前尚未见报道。本实验以大鼠为实验对象,观察了CNS海马、脑干以及脊髓三个部位E20，2、6、10 w、1 y 5个时间段OMgp mRNA的表达情况,发现至少在胚胎末期(E20)OMgp mRNA已经开始表达,而从出生后到6 w其表达一直呈上升趋势,之后有所下降。在海马和脊髓,OMgp mRNA的表达10 w与1 y有显著差异(P<0.05),说明在这两个部位OMgp mRNA的表达从10 w之后仍然呈下降趋势。Vourc'h等[2]曾报道大鼠OMgp mRNA的表达在生后第6周略有下降,到成年时趋于稳定,但其观察时期只到生后10周为止。而我们的实验证明,至少在大鼠的海马和脊髓两个区域,OMgp mRNA的表达从生后第6周直至老年时期(1 y)仍然是呈下降趋势。

　　成年哺乳动物体内,OMgp发挥了CNS损伤后抑制轴突再生的作用[8,9],而在发育过程中OMgp的作用尚不清楚。成年动物中正常的环境因子对防止轴突异常生长、保持突触的正常联系是十分重要的,CNS损伤后星形胶质细胞及其相关联的蛋白多糖分子如硫酸软骨素蛋白多糖(chondroitin sulfate proteoglycan,CSPG)以及Tenascin等的存在可能发挥防止轴突异常生长、形成异常连接的作用[10]。鉴于OMgp在CNS的分布以及损伤后的抑制效应,推测OMgp在CNS发育中可能也是作为一种正常的环境因子参与轴突生长与突触联系的调节,因此随着发育时间的推移,神经元逐渐成熟,OMgp的表达也相应逐渐下降。另外,CNS髓鞘完整性的维持需要少突胶质细胞和神经元轴突间的识别与相互作用,另一种髓鞘抑制蛋白MAG就在其中发挥着重要作用[11],由于OMgp与CNS髓鞘化的相关性,OMgp可能也和MAG一样在髓鞘完整性的维持中起着类似的作用。

　　NgR是一种糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白,由Fournier等在2001年运用碱性磷酸酶融合技术首次发现。NgR最初是作为Nogo的受体而被认识的,后来发现它同时也是MAG和OMgp的受体。Mingorance等[12]报道在小鼠发育过程中,海马部位的NogoA蛋白表达从E16到P0P5阶段一直是在增强的,随后表达下降直到成年,而相应的NgR蛋白表达则是从P0P7逐渐增强,因此NogoA并不能通过与NgR结合来抑制胚胎期海马神经元。虽然对大鼠CNS发育中的不同部位进行RTPCR检测发现E20已有NgR mRNA的表达,但免疫组织化学染色在E20却未能检测到NgR的表达,这可能与两者检测水平不同有关。前者检测的是mRNA,而后者检测的是蛋白,因此RTPCR检测到的表达时相要早于免疫组织化学。从出生后2 w到10 w NgR的表达明显增强:2 w时大脑皮层、海马、脑干等处神经元均呈现较弱的免疫反应性,10w时相同部位的神经元已具有很强的免疫反应性,脊髓灰质的前、后角神经元胞体也具有较强的免疫反应性,但Hunt等[5]用原位杂交检测脊髓NgR mRNA的表达情况却发现颈段、腰段脊髓NgR mRNA的表达普遍很低(但运动神经元信号却很强烈),两种结果不一致可能是因为采用的方法不同所致。

　　图1 RTPCR显示中枢神经系统发育过程中OMgp和NgR的表达1A1C,1G发育过程中OMgp mRNA在海马、脑干和脊髓的表达。1D1F,1H发育过程中NgR mRNA在海马、脑干和脊髓的表达。*:P<0.05 vs 10w图2 免疫组织化学显示中枢神经系统发育过程中NgR的表达AC,C'海马横切显示NgR在2w(A)和10w(B,C,C')的表达。C是C'的高倍放大。D脊髓横切显示出生后10w NgR在少突胶质细胞(箭头所示)表达。　　另外,在观察脊髓切片时我们还发现,2w时脊髓白质部分未能检测到NgR的表达,而10w时则明显可以看到NgR在白质少突胶质细胞表面的分布,免疫反应阳性物质集中于胞体和突起,说明成年大鼠脊髓白质有NgR的表达,而在发育中至少从E20到2 w这段时间脊髓白质都没有NgR表达。以往的研究表明,NgR广泛分布于CNS多种类型的神经元中[5]以及脊髓白质的少突胶质细胞中[6],本实验结果进一步表明,大鼠发育早期脊髓白质少突胶质细胞并无NgR的表达,至于成年后NgR在脊髓白质少突胶质细胞表达的意义,由于NgR定位于胶质细胞间缝隙连接的膜上,有报道推测可能在胶质细胞间的通讯中发挥一定的功能[13],或具有与再生无关的某些生理功能[6]。NgR作为髓鞘抑制蛋白Nogo、MAG、OMgp的受体,定位于神经元表面,这与少突胶质细胞表面的抑制因子通过神经元表面的NgR发挥轴突再生的抑制作用是相符合的。然而NgR在发育早期(E202w)不表达于少突胶质细胞,成年时在少突胶质细胞又有表达,这种表达变化及其意义还有待进一步研究。

　　本研究从mRNA和蛋白水平初步探讨了大鼠CNS从胚胎期经成年期直至老年期的整个发育过程中,髓鞘抑制蛋白OMgp及其受体NgR的表达及意义。虽然都是CNS再生抑制相关蛋白,但两者在发育中的表达规律提示,可能还存在与再生抑制无关的其他功能,有待进一步研究。

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