波形蛋白、细胞角蛋白5，18，19在人胚胎前列腺发育不同阶段的表达及意义

    Expression of vimentin, CK5, CK18, CK19 in human fetal prostate of various gestation stages

　　He Hui, Zhu Guodong, Ning Liang, Zhau E.Haiyen, Chung Leland WK, He Dalin, Nan Xunyi

　　(Urology Institute, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China;Department of Urology, Emory University, USA)

　　ABSTRACT: Objective  To study and evaluate the changing staining pattern of Vimentin, Cytokeratin (CK) 5,18,19 in the fetal human prostate with various gestation stages. Methods  5 fetal human prostate specimens with different developmental stages (2 month, 3 month, 5 month, 6 month, and 8 month respectively) and 1 normal adult human prostate specimen were included in this study. Using immunohistochemistry technique, all the specimens were stained with antihuman Vimentin, CK5, CK18 and CK19 antibodies. All the slides were observed under light microscope. Results  Vimentin was expressed in fetal human prostate epithelium, and its expression was gradually increased and latter decreased as the fetus grew. The CK5 and CK18 positive epithelial cells were unorderly distributed within the whole budding tips or the acini firstly. As the fetus grew, they were localized within the basal cell compartment and luminal cell compartment respectively. The CK19 positive cells were uniformly distributed within all the basally and luminally located cells, and this staining pattern was not altered as the fetus grew. Conclusion  The presence of Vimentin in the fetal human prostate could elevate the motility of the epithelial cells, and prompt the morphogenesis of the primary gland. The dynamic distributions of the CK5, CK18, CK19 positive cells within the budding tips, the acini, and the branching ducts could be possibly associated with the differentiation of fetal prostate epithelium.

　　KEY WORDS: human fetal prostate; vimentin; cytokeratin

　　摘要：目的  探讨波形蛋白(Vimentin)，细胞角蛋白(Cytokeratin)5、18、19(CK5、18、19)在人胚胎前列腺发育不同阶段组织及细胞中的定位表达变化及其在前列腺胚胎发育中的意义。方法  应用免疫组织化学方法研究Vimentin、CK5、CK18、CK19在不同胎龄前列腺组织中的表达变化。结果  胚胎前列腺上皮细胞中波形蛋白随胎龄增大其表达呈由弱到强，又由强减弱的变化趋势；CK5和CK18的表达起初分布无规律，但是随胎龄增大，CK5和CK18逐渐分别定位表达于基底细胞层和管腔上皮细胞层；CK19则在基底细胞层和管腔上皮细胞层中均有表达，且强度较一致，基本不随胎龄增大而变化。结论  胚胎前列腺上皮细胞Vimentin的表达，可能有助于上皮细胞的游走迁移，以形成早期原始腺体。CK5、CK18以及CK19阳性细胞在原始腺体中的动态分布与胚胎前列腺上皮细胞的分化状态有关。

　　关键词：胚胎前列腺；波形蛋白；细胞角蛋白

　　波形蛋白(Vimentin)和细胞角蛋白(Cytokeratin,CK)均属于细胞中间纤维蛋白家族的成员，参与细胞骨架的构成。Vimentin是间质细胞特异性表达的一种中间纤维蛋白。但在某些条件下，也可以出现在上皮细胞中\[1\]。Vimentin与细胞的生长分化状态以及细胞游走迁移有关\[23\]。CK是各种单层上皮、腺上皮以及复层上皮所表达的一种中间纤维蛋白，现已发现了20种。不同组织来源及不同分化状态的上皮细胞CK的表达具有一定特异性，CK表达谱的改变可以作为上皮细胞分化过程的标志物\[46\]。本研究旨在观察胚胎前列腺发育的不同时期Vimentin和CK5、CK18、CK19的定位表达及变化，探讨其在胚胎前列腺发育过程中的意义。

　　1  材料与方法

　　1.1  标本收集及制备  5例胎龄分别为2月、3月、5月、6月、8月的前列腺标本来自引产胎儿，胎龄依据产妇末次月经和胎儿的顶臀径进行估算。1例成人前列腺标本作为对照。所有标本均经10%(体积分数)甲醛溶液固定24h后，常规石蜡包埋，切片厚度4μm，行免疫组化染色。

　　1.2  主要试剂  一抗：Vimentin单克隆抗体购自美国Dako公司，CK18、CK19单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，CK5单克隆抗体购自英国Novocastra Laboratories Ltd公司。免疫组化试剂盒购自美国BioGenex Lab.公司。

　　1.3  免疫组化染色  实验操作按试剂盒说明书进行。切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化(100%-70%)、蒸馏水漂洗3min后，置于0.01mol/L 柠檬酸钠缓冲液，微波处理10min共2次，自然冷却至室温，PBS洗涤，Super Block封闭30min，吸去多余正常血清，加一抗，4℃冰箱过夜。PBS洗涤，加Multilink 37℃孵育30min，PBS漂洗，加Label湿盒内室温孵育30min，PBS洗涤，DAB显色，常规脱水、透明、封片，光学显微镜下观察。同时设置以PBS代替第一抗体染色作为阴性对照，同一切片的非染色部位作为阳性部位的自身对照。

　　1.4  结果判断  参照对照切片结果，在排除边缘效应、非特异性染色等干扰因素的基础上，实验切片细胞胞浆内出现棕黄色颗粒判断为阳性细胞。

　　2  结果

　　2.1  Vimentin在不同胎龄前列腺中的表达  各胎龄胚胎前列腺组织中，前列腺间质细胞均表达Vimentin，且分布均一，不同胎龄之间未见明显差异(图1)。前列腺上皮细胞中Vimentin的表达变化较大。2月胎龄时，仅个别前列腺芽突的少数上皮细胞中有表达，且多分布于芽突的周边(图1a)。随胎龄增大，Vimentin阳性上皮细胞不断增多，到5月胎龄时，几乎所有芽突和芽管中均有Vimentin阳性的上皮细胞，且芽突或芽管的分化程度越低，Vimentin阳性上皮细胞的数目越多(图1b)。6-8月胎龄时，芽突或芽管中Vimentin阳性的上皮细胞仅分布在分化不成熟的芽突或芽管中，而在分化较成熟的芽突或芽管中很少出现(图1c)。

　　图1  Vimentin在2月，5月，8月人胚胎前列腺中的表达 (SABC法)（略）

　　a: 2月龄，×200; b: 5月龄，×200; c: 8月龄，×100

　　2.2  CK在不同胎龄前列腺中的表达  CK(CK5、18、19)仅表达在腺上皮细胞中，间质细胞中无表达。2月胎龄时，可见芽突中有较多CK5阳性上皮细胞，在芽突中央和周边均有分布(图2a)。从2月胎龄到8月胎龄，CK5阳性上皮细胞由无规律分布逐渐定位于靠近芽突或芽管周边的基底细胞中。6月胎龄时，几乎所有芽突或芽管基底细胞均为CK5阳性(图2b)。

　　CK18的表达则与CK5相反。2月胎龄时，芽突中散在一些CK18阳性的上皮细胞，分布无一定规律(图2c)。随胎龄增大，CK18阳性细胞逐渐定位于靠近芽突或芽管中央的管腔上皮细胞层中；6月胎龄时，几乎所有的芽突或芽管的管腔上皮细胞均为CK18阳性(图2d)。

　　CK19的表达从2月胎龄起，几乎在所有芽突中的上皮细胞均表达阳性。CK19在各不同胎龄前列腺管腔上皮细胞和基底细胞中均有较多阳性表达细胞，似与胎龄不同无关(图2e、f)。

　　成人前列腺组织中Vimentin仅表达在间质细胞，CK5仅表达在基底细胞，CK18仅表达在管腔上皮细胞，而CK19基底细胞和管腔上皮细胞均表达，且以基底细胞为主(图3)。

　　3  讨论

　　人类前列腺在胚胎第10周起开始发育\[7\]，尿生殖窦上皮向其周围的间质中生长，形成芽突。芽突在雄激素及多种旁分泌生长因子的调控下，通过上皮与间质的相互作用，继续向周围的间质中生长，逐渐形成芽管和腺管。同时，其周围的原始尿生殖窦间质也通过与上皮的作用，逐渐分化为由平滑肌、成纤维细胞以及神经血管成分构成的结缔组织，最终发育形成一个具有复杂导管系统的复合腺体\[89\]。

　　图2  CK5，CK18，CK19在2月龄及6月龄人胚胎前列腺中的表达 (SABC法)（略）

　　a: CK5，2月龄，×200; b: CK5，6月龄，×200; c: CK18，2月龄，×200; d: CK18，6月龄，×200; e: CK19，2月龄，×200; f: CK19，6月龄，×200

　　图3  Vimentin, CK5, CK18, CK19在正常成人前列腺中的表达 (SABC法)（略）

　　a: Vimentin, ×200; b: CK5，×200; c: CK18，×200; d: CK19，×200

　　在多细胞生物胚胎发育过程中，某些上皮细胞在与其周围间质的相互作用过程中，逐渐获得了一些间质细胞的特有性状，表现为：丧失部分上皮细胞特征(细胞间连接丢失，某些粘附分子下调，细胞极性丧失)、获得部分间质细胞特征(成纤维细胞样外形，波形蛋白等间质细胞特有蛋白的表达)。这种现象被称为“上皮—间质转化”(epithelial mesenchymal transition, EMT)\[10\]。EMT在胚层分化、体节形成、器官发生及外周神经系统发育中发挥重要作用\[1112\]。EMT也是肿瘤侵袭、转移的重要内在机制之一\[1314\]。

　　Vimentin是细胞的骨架成分，主要表达于间充质来源的细胞及某些未分化细胞中。上皮细胞表达Vimentin被认为是EMT的可靠指标\[13\]。Sarnat研究发现，Vimentin在未成熟的神经细胞中有一过性表达，而在发育成熟的神经细胞则无表达\[15\]。Wernert等发现在人胚胎前列腺上皮细胞中Vimentin表达\[16\]。Putz等发现前列腺癌、乳腺癌、肺癌和结肠癌患者的转移灶肿瘤细胞Vimentin高表达，并认为这些癌细胞发生了EMT\[17\]。

　　我们发现前列腺胚胎发育过程中上皮细胞出现Vimentin的表达，其表达水平与前列腺腺体的发育进程相关。在腺体形成早期，少数上皮细胞即出现Vimentin表达，后随胎龄增大，Vimentin表达阳性细胞增多。同一胎龄前列腺中未成熟腺体Vimentin表达阳性细胞多，腺体结构基本形成的上皮细胞则大多丧失Vimentin的表达。这一结果提示，在前列腺胚胎发育过程中存在EMT现象。我们认为，前列腺胚胎发育早期，上皮细胞通过EMT获得了较强的游走能力，从而有利于这些细胞向周围间质中侵入性生长，形成芽突和芽管。而在腺体大体结构发育基本完成时，上皮细胞Vimentin的表达水平逐渐下降，细胞又恢复了正常的上皮细胞特性。

　　CK表达谱的变化是上皮细胞分化的重要标志，广泛应用于分辨不同组织来源及分化状态的上皮细胞\[1819\]。CK8/18是分化成熟的前列腺管腔上皮细胞的标志物，CK5/14是分化成熟的基底细胞标志物\[20\]，CK19是介于管腔上皮和基底上皮之间的中间型上皮细胞(intermediate cell)的标志物，该型细胞被认为是基底型上皮向管腔型上皮分化的中间状态\[21\]。Xue等\[18\]对胎龄分别为17、19、27、32周的胚胎前列腺进行了CK表达的研究发现，基底细胞层中的上皮细胞CK表达谱是CK14+/5+/18-,与成人基底细胞类似，认为其可能与成人前列腺基底上皮一样，具有较强的增殖能力；而位于管腔细胞层中的上皮细胞CK表达谱是CK14±/5±/18+,认为这些细胞是未分化成熟的管腔上皮，带有基底细胞的特点。指出胚胎前列腺上皮的分化方向是由基底细胞向管腔细胞分化的。

　　Wang等\[22\]对胚胎尿生殖窦、胚胎前列腺以及成人正常前列腺组织进行了CK表达的研究，进而提出了胚胎及成人期前列腺上皮的“干细胞”起源分化模型，认为胚胎期前列腺尿生殖窦上皮是前列腺的干细胞，它可以表达基底和管腔上皮所有类型的CK，该干细胞随胚胎发育逐渐定位于基底细胞层中，其增殖和分化能力可以一直延续到成人期，只是在成人期其数量非常稀少。在胚胎及成人期，该干细胞均可以通过一方面保留CK14/15/19,逐渐丢失CK8/18而分化成基底细胞；另一方面保留CK8/18，逐渐丢失CK14/5而分化成管腔上皮细胞。结合本研究中发现的CK5和CK18阳性的细胞随胎龄增大，由起初在芽突和芽管上皮中的无序性分布到逐渐形成有序性分布，可以认为，这一动态分布现象与胚胎前列腺上皮的分化有关，与Wang等提出的“干细胞”起源分化模型类似。本研究还发现胚胎前列腺的基底细胞层和管腔细胞层中均有较多CK19阳性的上皮细胞，与Wang等人的结果一致，可以认为这些细胞正处于分化的中间状态。

　　鉴于前列腺癌与前列腺的胚胎发育在组织学和某些分子机制上所具有的相似之处，有学者认为前列腺癌是前列腺胚胎发育过程的“再唤醒”。因此，研究前列腺胚胎发育的相关机制对理解和研究前列腺癌的发生机制有重要的借鉴意义。EMT在胚胎发育和其他肿瘤演进中的作用已受到广泛重视，在前列腺胚胎发育及前列腺癌演进中的作用，国内外鲜有报道。在细胞和分子水平对EMT在前列腺胚胎发育和前列腺癌演进中的作用进行深入研究，对揭示前列腺发育及前列腺癌演进的分子机制具有重要意义。

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　　(编辑  雷立权)

　　通讯作者：贺大林.

　　作者简介：何辉(1971),男(汉族),讲师,主治医师. Email: hhtao2001@yahoo.com.cn   

　　(西安交通大学医学院泌尿外科研究所，陕西西安  710061；Department of Urology, Emory University, USA)