DNA芯片技术筛选膀胱移行细胞癌信号转导相关基因

　　DNA chip analysis of signal transduction genes in human urinary bladder transitional cell carcinoma

　　Zhang Keqin, Jin Fengshuo, Ye Jin, Sun Zhongyi, Zhang Yong, Wu Gang, Gao Lin

　　(Department of Urology, Insititute of Surgery, Third Affiliated Hospital of Third Military Medical University, Chongqing 400042, China)

　　ABSTRACT: Objective  To investigate the change of signal transduction genes in human transitional cell carcinoma (TCC). Methods  DNA chip was used to detect the mRNA from 11 human transitional cell carcinoma tissues and to investigate the genes related to signal transduction. Results  Contrast to normal bladder mucous membrane tissues, there were 189 differentially expressed genes, in which 102 genes were obviously upregulated and 87 genes were obviously downregulated in human TCC tissues. There were 35 differentially expressed genes related to signal transduction, in which 13 genes were obviously upregulated and 22 genes were obviously downregulated. Conclusion  Many differentially expressed genes related to signal transduction play a role in the development of bladder transitional cell carcinoma.

　　KEY WORDS: bladder transitional cell carcinoma; signal transduction; DNA chip

　　摘要：目的  探讨人膀胱移行细胞癌信号转导相关基因的表达变化。方法  使用人肿瘤基因表达谱芯片检测11例膀胱移行细胞癌组织基因表达谱的变化，以寻找与细胞信号转导相关的差异表达基因。结果  以正常膀胱黏膜组织为对照，11例膀胱肿瘤组织中有87个基因表达明显下调，102个基因表达明显上调。其中与细胞信号转导相关的差异表达基因有35个，明显上调基因13个，明显下调基因22个。结论  膀胱肿瘤的发生与发展与多种细胞信号转导相关基因的异常表达有关。

　　关键词：膀胱移行细胞癌；信号转导；DNA芯片

　　为探讨细胞信号转导相关基因在膀胱肿瘤发生及发展中的作用，我们使用人肿瘤基因表达谱芯片对11例膀胱移行细胞癌组织的基因表达谱进行了测定，并进一步对差异表达的细胞信号转导相关基因进行了筛选，报告如下。

　　1  材料与方法

　　1.1  临床资料  11例膀胱移行细胞癌(transitional cell carcinoma, TCC)组织取自第三军医大学附属大坪医院泌尿外科2000年2月至2004年4月手术切除标本，均经病理证实。患者年龄在42岁至73岁，平均年龄54岁。3例肿瘤为单发，8例为多发，病灶大小1.0cm×1.5cm-2.8cm×3.5cm。病理分级：Ⅰ级4例，Ⅱ级4例，Ⅲ级2例，Ⅰ-Ⅱ级1例。临床分期(UICC)：Tis 1例，Ta 2例，T1 6例，T2 2例。正常组织取自距肿瘤基底部至少2cm以外黏膜，且经组织学检查证实。

　　1.2  组织总RNA提取及mRNA纯化  采用异硫氰酸胍一步法抽提正常膀胱黏膜组织和TCC组织总RNA，按Qiagen公司Oligotex mRNA Midi Kit的操作说明书纯化mRNA，-80℃保存备用。

　　1.3  荧光探针的标记及DNA芯片制备  参照Schena等\[1\]的方法逆转录标记cDNA探针并纯化。Cy3dUTP标记正常组织mRNA(3μg)，Cy5dUTP标记TCC组织mRNA(3μg)。BioDoor4000D人肿瘤基因表达谱芯片\[2\]，由上海博道基因有限公司提供。将基因芯片和杂交探针在95℃水浴变性5min，将混合探针加在基因芯片上，置于60℃杂交15-17h。依次以2×SSC+0.2% SDS、0.1%×SSC+0.2% SDS、0.1%×SSC洗涤10min，室温晾干。

　　1.4  检测与分析  用Scan Array 3000扫描仪分别于下列波长下扫描芯片：Cy3：532nm；Cy5：635nm。然后采用ImaGene3.0软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度，计算Cy5/Cy3比值。用以下条件作为判断基因表达显著的标准：Cy5/Cy3大于2.0的基因确定为表达明显上调基因；Cy5/Cy3小于0.5的基因确定为表达明显下调基因。

　　2  结    果

　　2.1  正常膀胱黏膜和TCC组织总RNA和mRNA的定性和定量分析  采用异硫氰酸胍一步法提取正常膀胱黏膜和TCC组织总RNA，经测定总RNA A260/A280都介于1.94-2.01。总RNA电泳(见图1)表明28s、18s清楚，且28s的量约为18s的两倍，RNA无明显降解，可以用于mRNA纯化。

　　图1  正常膀胱组织及TCC组织总RNA电泳图　略

　　2.2  基因芯片杂交结果分析  芯片杂交后分别于532nm(Cy3)和635nm(Cy5)扫描，其中Cy3图像和Cy5图像分别代表这张芯片中作为对照的正常膀胱组织中和膀胱TCC的基因表达情况，将Cy3图像与Cy5图像叠加，比较它们的信号强弱。双色荧光标记叠加图中，对于某一点的两种叠加荧光信号，如果Cy3的荧光信号较强，该点多显绿色，表明该基因呈下调趋势；如果Cy5的信号较强，该点多显红色，表明该基因呈上调趋势；如果强度相似，即显黄色，表明该基因的表达无明显差异(见图2)。按照筛选标准，筛选出Cy5/Cy3小于0.5的基因共计87个，为明显下调的基因；大于2.0的差异表达基因为明显上调的基因，共计102个。

　　图2  基因芯片扫描结果双色荧光叠加图　略

　　2.3  细胞信号转导相关基因的筛选  进一步登录基因Bank对差异表达的基因功能进行分类，发现有13个细胞信号转导相关的基因表达明显上调(见表1)，22个细胞信号转导相关的基因表达明显下调(见表2)。

　　表1  TCC组织中与细胞信号转导相关的上调基因　略

　　表2  TCC组织中与细胞信号转导相关的下调基因　略

　　3  讨    论

　　膀胱肿瘤是我国泌尿生殖系统最常见的肿瘤，移行细胞癌是其最常见的病理类型。肿瘤发生发展的许多环节尚不能用单一的分子或基因变化来解释，它是一个复杂的多阶段的过程，是多因素参与、多步骤完成的，是多种肿瘤相关基因表达失常或肿瘤抑制基因失活所致。基因芯片技术能大规模、高通量、和高平行性地研究成千上万个基因的表达情况，利用基因芯片可筛选疾病相关基因、研究新基因的功能、诊断各类遗传性疾病、研究药物作用机制及筛选药物靶点等\[34\]。本研究利用基因表达谱芯片这一高通量高度敏感的生物技术，对人正常膀胱黏膜组织及TCC组织的基因表达谱进行了研究，并进一步对细胞信号转导相关的基因进行了筛选，以期更全面地了解膀胱肿瘤发生及发展时基因变化的特点和机理，明确这些基因与肿瘤的关系，用于肿瘤的早期诊断。本实验结果表明：有众多与细胞信号转导相关的基因表达异常，其中原发TCC及复发TCC组织中，与细胞信号转导相关的上调基因有13个；与细胞信号转导相关的下调基因有22个。细胞信号转导是指细胞将胞外信号转换为胞内信使经级链反应使细胞作出应答反应的过程，即细胞将外界信号转换为细胞能“感知”的信号(细胞内第二信使等)，通过各种激活和抑制的调控机制，实现细胞的生理功能。该方向的研究与胚胎的发育，细胞的正常生长、分裂、凋亡，生命体各种生理功能，疾病的发生和治疗都有极密切的关系\[56\]。参与信号传导的物质包括各种物理的(力、温度、光、电、磁、射线等)和化学的(激素、递质、细胞因子、药物等)，生物膜上各种受体、离子通道，胞内作为第二信使的小分子和离子(cAMP、cGMP、IP3、DG、Ca2+等)，各种信号蛋白、多种激酶、多种调节基因表达活性的转录酶和DNA、mRNA等。细胞接受各种物理的和化学的刺激后，如何产生功能性反应？一般有四个阶段\[7\]：①与膜受体相互作用，把信号转导到细胞内；②细胞内各种第二信使分子之间及与一些蛋白激酶相互作用，导致信号的级联放大；③胞内信号分子或激活的转录因子进入细胞核内，启动基因转录，合成蛋白或多肽，调节细胞生理功能；④通过负性反馈或灭活，终止信号作用。现已知至少有5种以上信号跨膜转导通路，每条通路有多种信号分子参与，特别是各条通路间又有复杂的协同或抑制联系。同时，细胞间的信号传递又是协调“细胞社会”分工、合作的基本方式。细胞信号转导相关基因的异常表达，无论是表达升高还是减弱，都会对细胞的生理功能产生巨大影响，出现一系列严重后果，甚至肿瘤的发生、转移、复发。TCC组织中这35个信号转导相关基因的异常表达，可能与TCC的发生发展有一定的联系，其意义有待于进一步深入研究。

　　参考文献：

　　\[1\]Schena M, Shalon D, Davis RW, et al. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray \[J\]. Science, 1995, 270(5235):467470.

　　\[2\]Cheung VG, Morley M, Aguilar F, et al. Making and reading microarray \[J\]. Nature Genetics, 1999, 21(suppl):1519.

　　\[3\]张克勤，靳凤烁，高琳. 11例人膀胱移行细胞癌基因表达谱变化的临床分析 \[J\]. 重庆医学，2005, 34(3):412413.

　　\[4\]刘妍, 成军, 王春花, 等. 基因表达谱芯片技术筛选XTP1基因转染细胞差异表达分析 \[J\]. 胃肠病学和肝病学杂志, 2004,13(1):2427.

　　\[5\]Park H, Adams MA, Lachat P, et al. Hypoxia induces the expression of a 43kDa protein (PROXY1) in normal and malignant cells \[J\]. Biochem Biophys Res Commun, 2000, 276:321328.

　　\[6\]Kalaydjieva L, Gresham D, Gooding R, et al. Nmyc downstream regulated gene 1 is mutated in hereditary motor and sensory neuropathyLom \[J\]. Am J Hum Genet, 2000, 67:4758.

　　\[7\]林其谁. 跨膜信号转导 \[J\]. 生命科学,1996,8(1):

　　1.通讯作者：靳风烁(1955). Email: fengshuojin@hotmail.com

　　作者简介：张克勤(1965)，男(汉族)，博士，主治医生，讲师，主要从事泌尿系肿瘤的基础及临床方面的研究. Email: zhkq2000@sina.com   

　　第三军医大学大坪医院野战外科研究所泌尿外科，重庆  400042

　　(编辑  雷立权)