免疫组化方法研究女性胎儿尿道括约肌的神经支配

【摘要】  　　目的 探讨支配女性尿道括约肌神经纤维的定位、定量及定性。方法 12例21周至40周的女性胎儿尿道，分别进行石蜡包埋、胆碱乙酰基转移酶(choline acetylcatransferase, CHAT)及神经肽Y(neuropeptide Y, NPY)免疫组化染色，并对其结果进行半定量和定量分析。结果 从尿道内口至外口，神经肽Y阳性区域显色范围逐渐变小、强度减弱，胆碱乙酰基转移酶阳性区域主要位于尿道中三分之一，统计学上具有显著性差异。结论 尿道括约肌的胆碱乙酰基转移酶及神经肽Y免疫组化染色对理解参与控尿的尿道括约肌神经支配提供了很有价值的帮助。

【关键词】  控尿　神经支配　尿道括约肌　免疫组织化学

　　Innervation of the female human fetus urethral sphincter by immunohistochemical studies

　　Yang Rongchen, Zhou Rongxiang, Wang Peng, Chen Qiang

　　(Department of Urology, Qingdao Municipal Hospital, Affiliated to Medical College of Qingdao University, Qingdao 266011, China)

　　ABSTRACT: Objective  To explore the location, quantity and nature of nerve fibers innervating the urethral sphincter. Methods  Urethra of 12 female human fetuses between 21 and 40 weeks of gestation were treated by paraffin embedded with choline acetylcatransferase (CHAT) and neuropeptide Y(NPY) immunohistochemical staining. The staining results were analyzed quantitatively and semiquantitatively. Results  From the urethra internal orifice to external orifice, the positive region of NPY became smaller and the density thinner; the positive region of CHAT was mainly located in the middle part of arethra, and there was statistically significant difference between them. Conclusion  The immunohistochemical staining of choline acetylcatransferase and neuropeptide Y in the anatomical structures of the urethral sphincter provides a better understanding of the origin and nature of the innervation participating in urinary continence.

　　KEY WORDS: urinary continence; innervation; urethral sphincter; immunohistochemitry

　　女性尿道括约肌的内在机制是由平滑肌和横纹肌成分组成，它们各自接受相互独立的神经支配，这些机制目前尚不十分清楚[1]。大多数学者认为女性尿道括约肌是由来自阴部神经(躯体神经)和盆丛(自主神经)的神经纤维共同支配[2]，但有关女性尿道括约肌及其支配神经精确的定位、定量及定性方面的研究在国内外报道较少。本实验采用免疫组织化学染色及显微图像分析技术，对国人正常女性胎儿尿道的胆碱能及肾上腺素能神经进行定位、定量研究，从而探讨它们在控尿方面的作用。

　　1  资料与方法

　　1.1  资料  选取12个正常女性胎儿，21-40周胎龄。测其冠臀长度为165-340mm，胎儿死亡1h内完整取下尿道，尿道长度为9-15mm，另取成人新鲜大脑皮质及肾上腺髓质标本做阳性对照，以上标本均经40g/L多聚甲醛固定后石蜡包埋。
   
　　我们应用12个21-40周胎龄的女性胎儿尿道，是因为胎儿在妊娠15周时横纹肌和平滑肌之间已显示出明显的区别[3]，这个阶段的胎儿能够在肉眼下解剖，括约肌的基本类型已经建立[4]。

　　1.2  试剂和仪器  NPY多克隆抗体购自武汉博士德生物制药有限公司，CHAT多克隆抗体及ABC检测试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司，Biogenex i6000全自动免疫组化染色系统由广州新捷仪器有限公司生产，Quantimet970型显微图像分析仪产自英国剑桥仪器公司。

　　1.3  方法

　　1.3.1  制作切片  将石蜡包埋的女性尿道标本从内口至外口做连续切片，片厚4μm，根据尿道长度平均分成8个截面，加之内、外口，每个截面各取2张切片，分别做CHAT和NPY染色。

　　1.3.2  免疫组化染色  常规ABC法。切片脱蜡至80%(体积分数)乙醇，甲醇H2O2溶液中震荡10min，置于枸橼酸盐缓冲液中，微波炉加热12min，温度在96℃左右，取出后自然冷却(抗原修复)。一抗分别为多克隆抗CHAT抗体及多克隆抗NPY抗体，湿盒内孵育60min，二抗37℃  30min，三抗37℃ 50min，DAB液显色约8min。以成人大脑皮质作CHAT的阳性对照，成人肾上腺髓质作NPY的阳性对照，以TBS缓冲液代替一抗作阴性对照。一抗稀释度为1∶200。

　　1.4  观察指标  采用半定量的方法根据免疫组化反应呈色深浅及反应颗粒多少，将酶活性反应强度分为：(-)阴性，(+)阳性，()中等阳性，()强阳性，四个级度，将其用数字化表示分别为0-3，进行统计学处理。
   
　　切片中CHAT及NPY阳性区域显色为棕黄色至棕褐色，经显微摄像扫描后，将图像输入计算机，采用显微图像分析技术对计算机图像进行定量分析。

　　1.5  统计学分析  实验数据用±s表示，统计分析采用SPSS11.5软件包，两样本均数差别应用t检验，P<0.05为差异有显著性。

　　2  结果
   
　　观察21-40周女性胎儿尿道的组成，可见胎儿尿道已具有三层基本结构，发育良好：内层为充满皱折的黏膜，中间为黏膜下血管组织，外层为纤维肌肉鞘，由平滑肌和横纹肌弹性组织组成。

　　2.1  肾上腺素能神经的分布  NPY免疫组化染色分析提示，交感神经介质NPY免疫组化阳性纤维呈棕黄色，多位于血管壁中层平滑肌细胞间和神经束中，在部分细小动脉壁可观察到较粗大的阳性纤维。从尿道内口至外口，NPY染色阳性区域(尿道平滑肌)逐渐变小，颜色变浅，至外口处几乎完全消失(图1)。将NPY免疫组化反应强度“0-3”数字化后结果可见：近1/3与远1/3，中1/3与远1/3之间差异均有显著性(P<0.01)，但近1/3与中1/3之间差异无显著性(P>0.05，表1)。

　　图1  12例女性胎儿尿道免疫组化染色分析(半定量)（略）

　　2.2  胆碱能神经的分布  从CHAT免疫组化反应染色分析可见女性胎儿尿道的中间1/3染色最强，近端1/3次之，远端1/3最弱。将CHAT免疫组化反应强度“0-3”数字化后结果可见：远、中、近端三者差异均具有显著性(P<0.01，表1)，在膀胱颈部和尿道近1/3横纹肌纤维很少。

　　表1  女性尿道NPY与CHAT免疫组化分析结果（略）

　　注：近1/3是指图1中从内口至2；中1/3是图1中从3至5；远1/3是图1中从6至8. 与远1/3比较*P<0.01；与中1/3比较 ΔP<0.01

　　3  讨论
   
　　关于此项研究内容，国外的研究结果并不完全相符，甚至结论互相矛盾。女性尿道的复杂结构组成了混合的神经支配：自主神经支配平滑肌，躯体神经支配横纹肌，自主神经和感觉神经支配黏膜和黏膜下组织。平滑肌和横纹肌的连接也非常紧密，使得识别支配每种肌肉结构的神经纤维变得非常困难[5]。
   
　　女性尿道的尿道内括约肌主要由交感、副交感神经支配，尿道外括约肌主要由躯体神经支配，其中交感神经和副交感神经节前纤维为肾上腺素能神经，副交感神经节后纤维和躯体神经为胆碱能神经，其神经纤维末稍释放乙酰胆碱，作用于尿道外括约肌的N型胆碱能受体，引起该肌收缩，阻止尿液排出。
   
　　乙酰胆碱作为神经递质，作用于靶受体发挥作用。胆碱乙酰基转移酶是胆碱能神经元的标志酶，是乙酰胆碱的合成酶，分布在胆碱能神经元和纤维内；肾上腺素能神经释放单胺类递质，故可以用显示单胺类递质的方法来研究肾上腺素能神经纤维的分布，神经肽Y(NPY)是肾上腺素能神经的标志性神经肽。应用免疫组化染色来研究两种神经递质含量的多少，可说明神经的兴奋性高低，能充分反映神经的功能, 是了解胆碱能、肾上腺素能神经及其所支配器官的重要方法。
   
　　本实验研究对尿道肌肉组织进行组织学和免疫组织化学分析显示，在女性胎儿尿道的膀胱颈及近端三分之一，横纹肌纤维相对较少，这与Borirakchanyavat等[6]的观点相矛盾，他们发现胎儿的横纹肌纤维出现在尿道的近端及中间三分之一处，认为胎儿尿道的横纹括约肌向近端延伸，这些纤维在后侧表面是不完整的。
   
　　Stolzenburg等[7]认为女性膀胱逼尿肌止于尿道内口，与尿道无任何延续，尿道平滑肌的内纵肌在近端三分之一开始变薄，远端三分之二逐渐消失，外纵肌多数在尿道内口处消失，中间环形肌则在近端三分之一形成强大的环形平滑肌括约肌。本实验经过平滑肌标志性抗体(NPY)免疫组织化学染色证实，该括约肌向远端尿道逐渐减少，开始减少处恰好为横纹括约肌可检测的部位。在中间三分之一尿道平滑肌和横纹括约肌环绕整个尿道，平滑肌在尿道远端三分之一处消失。横纹括约肌开始于尿道近端三分之一的远端，位于平滑肌的外侧，向远端逐渐增厚。
   
　　本实验研究还从CHAT及 NPY免疫组化染色分析中发现女性胎儿尿道的中间1/3染色最强，在女性胎儿尿道的平滑肌与横纹括约肌之间并没有明显的界限，在尿道中三分之一处可清楚地看到平滑肌和横纹肌纤维互相交错分布，逐渐过渡，形成所谓的尿道括约肌复合体，是女性重要的控尿机制。Stein等[8]通过尿动力学检查发现，女性患者全膀胱切除术后施行原位尿流改道，其控尿功能完全依靠横纹括约肌，虽然尿道长度缩短了1.3cm，最大尿道压下降12cm H2O，却仍能有效地控制排尿。
   
　　Rother等[9]认为女性尿道的平滑肌具有括约肌作用，主要在持续控尿过程中发挥作用，能够控制尿道的关闭。横纹括约肌可以随意中断排尿、对抗压力性尿失禁，横纹括约肌在中间三分之一处最厚并且环绕尿道，并可见到平滑肌纤维与横纹肌纤维交错移行。
   
　　本实验应用免疫组化方法研究了12例21-40周胎龄的正常女性胎儿尿道，结果表明胆碱乙酰基转移酶及神经肽Y阳性区域主要位于尿道中三分之一，是胆碱能及肾上腺素能神经递质集中的部位，在女性尿道的控尿功能中发挥着极其重要的作用。这些知识有助于提高膀胱切除手术后保留尿道的控尿功能质量，也有助于理解控尿机制、对女性尿失禁进行更有效的管理。

【参考文献】
  　　[1]Creed KE. Innervation of the smooth muscle of the lower urinary tract [J]. J Smooth Muscle Res, 1995, 31(1):14.

　　[2]Elbadawi A, Schenck EA. A new theory of the innervation of the bladder musculature Part 2.Innervation of the vesicourethral junction and external urethral sphincter [J]. J Urol, 1974, 111(1):613615.

　　[3]Ludwikowiski B, Oesch Hayward I, Brenner E, et al. The development of the external urethral sphincter in humans [J]. SJU Int, 2001, 87(6):565568.

　　[4]Oelrich TM. The striated urogenital sphincter in the female [J]. Anat Rec, 1983, 205(5):203232.

　　[5]Tanagho EA, Schmidt RA, De Araujo CG. Urinary striated sphincter: what is its nerve supply [J]. Urology, 1982, 20(2):415.

　　[6]Borirakchanyavat S, Aboseif SR, Carrol PR，et al. Continence mechanism of the isolated female urethra: an anatomical study of the intra pelvic somatic verves [J]. J Urol, 1997, 158(1):822826.

　　[7]Stolzenburg JU, Dorschner W, Postenjak M, et al. Sphincteric musculature of female canine urethra in comparison to woman including 3D reconstruction [J]. Cells Tissu Organ, 2002, 170(6):151161.

　　[8]Stein JP, Grossfeld GD, Freeman JA, et al. Orthotopic lower urinary tract reconstruction in women using the kock ideal neobladder ;updated experience in 3 patients [J]. J Urol, 1997, 158(1):400405.

　　[9]Rother P, Dorschner W, Reibiger I, et al. Anatomic basis of micturation and urinary continence [J]. Surg Radio, 1996, 18(3):173177.

　　(编辑 钱春梅)

作者单位：青岛大学医学院附属市立医院泌尿外科，山东青岛 266011