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【摘要】 目的 探讨国人膀胱癌乙酰肝素酶的表达水平及其与膀胱癌发生、发展、转移和复发的关系。方法 应用免疫组化EnVision二步法研究58例膀胱癌患者中乙酰肝素酶蛋白的表达水平，10例正常膀胱黏膜为对照组。结果 乙酰肝素酶在膀胱癌中阳性表达22例(37.9%)，其表达率与肿瘤的病理分级、临床分期、复发和淋巴结转移有相关性(P<0.05)。结论 乙酰肝素酶蛋白的异常表达可作为膀胱癌患者发生和发展的预后参数。
【关键词】 膀胱肿瘤；乙酰肝素酶；免疫组化
Expression and clinical significance of heparanase in Chinese with bladder carcinoma
Lai Tan1, Tu Xiangan2, Lü Zili2, Zheng Keli2, Qiu Shaopeng2, Deng Chunhua2
(1. Department of Surgery, Dawang Destrict Peoples Hospital, Zhaoqing 526238; 2. Department of Urology, The First Affiliated Hospital, Sun Yatsen University, Guangzhou 510080, China)ABSTRACT: Objective To study the expression of heparanase in Chinese with bladder carcinoma and the relationship with its development, progression, metastasis and recrudesence. Methods Immunohistochemical technique was used to detect the expression of heparanase in 58 cases of bladder carcinoma. Results The positive protein expression of heparanase was 37.9% (22/58). The heperanase protein expression was correlated with the pathological type, clinical stage, recrudesence and lymph node metastasis (P<0.05). Conclusion Heparanase protein overexpression might serve as a marker for the prognosis of Chinese bladder carcinoma.
KEY WORDS: bladder neoplasm; heparanase; immunohistochemical technique
细胞外基质和基底膜是肿瘤细胞侵袭及转移的屏障。糖氨聚糖是此屏障的主要成分之一，它的主要成分为硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparansulfateproteoglycan, HSPG)。乙酰肝素酶(heparanase, Hpa)正是一种裂解糖氨聚糖中HS链的内切糖苷酶,在细胞侵袭中起着极其重要的作用。最近,随着Hpa基因得以克隆，相继获得一些有意义的实验结果，Hpa在侵袭性细胞穿越血管壁,实现浸润、扩散、转移过程中的关键作用受到广泛关注[1]。我们应用免疫组化EnVision二步法研究58例膀胱癌患者和10例正常膀胱黏膜乙酰肝素酶蛋白的表达水平，探讨膀胱癌中乙酰肝素酶的表达水平及其与膀胱癌发生、发展、转移和复发的关系。
1 资料与方法
1.1 临床资料 收集中山大学第一附属医院泌尿外科1998-2003年手术切除膀胱癌标本58例,男性47例，女性11例。年龄21-81岁，平均58.6岁。WHO病理分级：G1 17例，G2 25例，G3 16例。UICC临床分期：T1 32例，T2 14例，T3 12例。复发20例，未复发38例。淋巴结转移阳性15例，阴性43例。10例正常膀胱组织作为对照。
1.2 方法
1.2.1 试剂 鼠抗人乙酰化肝素酶单克隆抗体购自武汉博士德公司，EnVision二抗为DAKO公司产品，二氨基联苯胺(DAB)试剂盒购自福州迈新公司。全部标本均用10%(体积分数)中性甲醛固定，常规组织脱水、石蜡包埋，4μm厚组织切片，并进行HE染色，用于组织定位。
1.2.2 免疫组织化学染色 采用免疫组织化学染色EnVision二步法，实验步骤按试剂盒说明进行。乙酰肝素酶一抗工作浓度为1∶50，采用微波煮沸15min修复抗原，抗原修复液为0.01mol/L柠檬酸缓冲液(pH 6.0)。一抗4℃孵育过夜，PBS洗3次，EnVision二抗室温孵育40min，PBS洗3次后DAB显色3-5min，自来水终止显色，充分水洗后苏木精复染，常规脱水、透明、中性树胶封片。以已知阳性切片做阳性对照，阴性对照以PBS替代第一抗体。
1.2.3 结果判断 乙酰肝素酶阳性信号为细胞浆内呈现棕黄色颗粒，阳性细胞数<10%为(-)；阳性细胞数10%-50%为(+)；阳性细胞数>50%为()。
1.2.4 统计学分析 采用SPSS 13.0统计分析软件，χ2检验，以P<0.05为有统计学意义。
2 结 果
乙酰肝素酶蛋白在膀胱癌患者阳性表达率为37.9%(22/58)，其阳性颗粒定位于癌细胞浆内(图1)。G1、G2和G3期肿瘤中其阳性表达分别为2例(11.8%)、9例(36%)和11例(68.8%)；T1、T2 和T3期肿瘤中其阳性表达分别为6例(18.8%)、9例(64.3%)和7例(58.3%)；复发和未复发者肿瘤中其阳性表达分别为3例(15%)和19例(50%)；淋巴结转移阳性和阴性者肿瘤中其阳性表达分别为10例(66.7%)和12例(27.9%)；乙酰肝素酶蛋白阳性表达率与肿瘤的病理分级、临床分期、复发和淋巴结转移有相关性(P<0.05，表1)。10例正常膀胱组织均为阴性表达。
3 讨 论
恶性肿瘤的主要特点是浸润和扩散，该过程主要包括细胞与细胞及细胞与细胞外基质黏附降低，肿瘤细胞穿过细胞外基质，甚至穿过基底膜到达血管、淋巴管或周围组织。在这个过程中，黏附因子起重要的作用。膀胱癌是泌尿生殖系最常见的恶性肿瘤，容易复发扩散和转移。膀胱癌的扩散和转移是一较为复杂的过程，涉及多基因、多阶段的作用，是众多学者研究的热点，目前普遍认为细胞与细胞及细胞与基质间黏附性降低以及诱导血管形成是肿瘤浸润和转移的关键环节。
乙酰肝素酶又称内源性硫酸乙酰化肝素分解糖苷酶，在炎症状态下，乙酰肝素酶通过降解细胞表面与基质相互作用的硫酸乙酰化肝素链，有助于炎症细胞通过基底膜，移行到炎症部位，同时，乙酰化肝素酶还参与新生血管的形成[2]。肿瘤细胞穿透基底膜及细胞外基质以及新生血管形成是肿瘤扩散和转移的基本过程，乙酰肝素酶是否也参与该过程的调节，值得进一步研究。
Gohji等[3]应用免疫组化和原位杂交的方法研究67例膀胱癌乙酰肝素酶蛋白和基因表达，乙酰肝素酶蛋白在浸润性膀胱癌中的表达率(68%)明显高于浅表性膀胱癌(19%)，在低分化癌(79%)和淋巴结转移阳性癌(80%)中的表达率亦分别明显高于高分化癌(29%)和淋巴结转移阴性癌(39%)；乙酰肝素酶mRNA的表达也与临床分期和淋巴结转移呈正相关。进一步研究发现乙酰肝素酶表达高的膀胱癌组织其微血管计数明显高于乙酰肝素酶表达低的膀胱癌组织[4]。本组对膀胱癌的研究显示，尽管乙酰肝素酶阳性表达率比文献报道低，但仍与肿瘤的病理分级、临床分期、复发和淋巴结转移有相关性, 故认为乙酰肝素酶蛋白的异常表达有可能成为膀胱癌发生和发展的预后参数。
【参考文献】
[1]Vlodavsky I, Friedmann Y, Elkin M, et al. Mammalian heparanase: gene cloning, expression and function in tumor progression and metastasis [J]. Nat Med, 1999, 5(7):793802.
[2]GingisVelitski S, Zetser A, Kaplan V, et al. Heparanase uptake is mediated by cell membrane heparan sulfate proteoglycans [J]. J Biol Chem, 2004, 279(42):4408444092.
[3]Gohji K, Okamoto M, Kitazawa SI, et al. Heparanase protein and gene expression in bladder cancer [J]. J Urol, 2001, 166(4):12861290.
[4]Gohji K, Hirano H, Okamoto M, et al. Expression of three extracellular matrix degradative enzymes in bladder cancer [J]. Int J Cancer, 2001, 95(5):295301.
作者单位：(1. 广东省肇庆市大旺区人民医院外科，广东肇庆 526238；2. 中山大学附属第一医院黄埔院区泌尿外科，广东广州 510700)