以纤维蛋白凝胶为支架构建组织工程胃新膀胱的研究

【摘要】  目的 探讨以纤维蛋白凝胶为支架，通过组织工程技术以胃重建膀胱的可行性。方法 从实验动物获取膀胱黏膜，体外培养并扩增移行上皮细胞。分别通过纤维蛋白凝胶(实验组)和keratinocyteSFM(对照组)将单个细胞悬液移植于带血管蒂的去黏膜胃片，将胃片缝成囊状(新膀胱)，固定于腹壁。于术后2、4、6、8周取胃片进行组织学及免疫组化分析。结果 实验组术后随时间延长新膀胱有不同程度挛缩；HE染色提示胃囊腔面有上皮样细胞覆盖，2周时细胞覆盖率约50%，4-8周时约70%。这些细胞分布不均匀，分层不明显；上皮样细胞AE1/AE3染色和CK7染色均阳性。对照组各标本均严重挛缩，腔隙消失，无上皮覆盖。结论 将体外培养扩增的尿路上皮细胞通过纤维蛋白凝胶移植至去黏膜胃片，可以使去黏膜胃片移行上皮化，从而重建膀胱。

【关键词】  纤维蛋白凝胶；移行上皮；组织工程；膀胱成型术

    Study on the construction of gastric bladder using fibrin glue as the tissue engineering scaffold

    Yang Zhonghua, Wang Xinghuan, Wang Huaipeng, Luo Yaoxiong, Liu Jiumin

    (Depatment of Urology, Guangdong Provincial Peoples Hospital, Guangzhou 510100, China)ABSTRACT: Objective  To explore the feasibility of constructing gastric bladder using fibrin glue as the tissue engineering scaffold. Methods  Urothelial cells were isolated and propagated in vitro from open bladder biopsies taken from 17 pigs. The single cells were suspended in fibrin glue(experimental group) and keratinocyteSFM (control group) respectively, and then were transplanted onto free patch of demucosalized stomach tissue based on the right gastroepiploic artery. We then sew the patch into pockets (artificial bladder) and fixed them onto the abdomen wall, retook the artificial bladder for histologic and immunohistochemical analysis at different postoperative interval (2, 4, 6 and 8 weeks). Results  In the trial group, macroscopically, the demucosalized stomach pockets shrank in different degree. Histological analysis showed that the surfaces of the artificial bladder were covered by a layer of epitheliallike cells, which covered the surfaces unevenly and stratified unclearly. Immunohistochemical analysis showed that the covering epitheliallike cells were positively stained with CK7. In the control group, the artificial bladders shrank and adhered so gravely that there were no existing lacuna. Conclusion  It is available to transplant the transitional cells cultured in vitro onto the demucosalized patch of stomach so as to reconstruct functional gastric baldder.

    KEY WORDS: fibrin glue; transitional cell; tissue engineering; cystoplasty
   
    用胃肠道扩大和重建膀胱已有100多年的历史，尽管存在诸多并发症[1]，由于缺乏更好的替代物，至今仍是膀胱扩大术的“金标准”。这些并发症由覆盖于胃肠道的具有重吸收和分泌功能的上皮细胞所致，而不是平滑肌，因此有学者提出“复合”膀胱成形术的概念，即利用体外培养的尿路上皮细胞和去黏膜的胃肠道组织重建膀胱[23]。种子细胞体外培养是组织工程的关键技术之一，而选择一种理想的载体，将体外培养的细胞移植于组织替代物而满足组织工程需要，一直是研究者致力于解决的问题。本实验探讨应用纤维蛋白凝胶为支架构建组织工程胃新膀胱的可行性。

    1  材料与方法

    1.1  细胞培养和鉴定  取2-3个月龄广西长白猪(广州试验动物场)，雌雄不限，体重15-18kg。氯胺酮诱导(10mg/kg)麻醉后丙泊酚(4-12mg/kg·h)静脉维持。楔形切取全层膀胱组织，面积约1.5-2.0cm2，置入4℃含100g/L血清的DMEM(Gibco)中送实验室。用可吸收线双层缝合膀胱，证实无尿液渗漏后关闭腹腔。

    无菌条件下剥离膀胱黏膜，用含500u/mL青霉素/链霉素(Hyclon)的PBS液反复清洗并将黏膜剪成糊状，置入三角瓶中，加入30-50倍体积的200u/mL胶原酶Ⅰ(Gibco)，室温搅拌消化60-90min，100目筛网过滤，1000r/min离心3min，弃上清，PBS清洗后将细胞接种于T25培养瓶以keratinocyteSFM(Gibco)培养(37℃、5%CO2)。待细胞达80%－90%融合时以1∶2传代，继续培养。细胞爬片：用40g/L多聚甲醛固定，以抗角细胞广谱角蛋白单克隆抗体(AE1/AE3) (福建迈新)为一抗，以DAB为底物，应用免疫过氧化物酶法显色。

    1.2  移行上皮细胞纤维蛋白原悬液的制备  当细胞生长达足够数量后以2.5g/L胰酶消化，离心，清洗，获取单个细胞悬液，细胞计数及台盼蓝活性检测。将纤维蛋白凝胶两种成分纤维蛋白原和凝血酶原分别溶解于2.5mL PBS和同体积的氯化钙溶液，实验组以凝血酶原溶液重悬单个细胞，对照组以keratinocyteSFM重悬单个细胞，备用。

    1.3  去黏膜胃片的制作  再次麻醉动物，取上腹部正中切口，仔细游离胃网膜血管弓，保留胃网膜右血管蒂，切取胃体部楔形胃片，面积约12-18cm2；以1号和4号丝线间断双层缝合胃切缘，以恢复其连续性。用75%(体积分数)的乙醇清洗楔形胃片黏膜面，生理盐水多次清洗后，用电刀将黏膜层和黏膜下层剥除，电凝止血，生理盐水再次清洗。

    1.4  移行上皮细胞的自体移植  证实去黏膜胃片无胃黏膜残留后彻底止血，测量胃片面积。将含细胞的纤维蛋白原溶液和凝血酶原溶液通过双联注射器同时喷涂于去黏膜胃片(图1)，约1min后纤维蛋白凝胶凝固。将去黏膜胃片对折(黏膜面朝内)缝合成囊状后固定于腹壁，注意避免血管蒂扭转。

    对照组则将细胞悬于4mL keratinocyteSFM中，待胃片缝合成囊状后注入。术后禁食24h，随即给予正常饮食。术后3d内注射青霉素。分别于细胞接种后2、4、6、8周处死动物(每组4只，对照组和实验组各半)。取回已种植移行上皮细胞的胃囊(新膀胱)，展开胃片测量其表面积后，10%(体积分数)甲醛固定，48h后切片进行HE染色以及免疫组化染色(CK7)(福建迈新)。

    2  结    果

    试验广西长白猪17头，一只死于麻醉意外，其余动物生长良好，无营养不良。

    2.1  细胞培养和鉴定  原代及传代培养细胞在6-8d左右达90%融合。平均每膀胱组织标本可以获得尿路上皮细胞数量约3.2×105(2.8×105-3.6×105)，经过原代和一次传代培养后可获得尿路上皮细胞约3.2×106-4.5×106，在细胞重悬于纤维蛋白凝胶溶液时其活性在87%以上。该细胞抗广谱角蛋白免疫组化染色(AE1/AE3)可见胞浆呈棕黄色，胞核淡蓝色，为阳性染色。

    2.2  大体标本  实验组：去黏膜胃片面积约9-15cm2，将去黏膜胃片固定于腹壁后，其血供稳定，未发现有胃新膀胱坏死者；并且在术后2-8周，随时间的延长，胃片面积有不同程度的挛缩。部分标本因腔内发生纤维化粘连管腔消失，其余腔面欠光滑，无粘液存留及结石形成等。对照组：各新膀胱严重挛缩粘连，成结节状纤维化，腔隙已不存在。

    2.3  组织学和免疫组化分析  HE染色提示在胃片腔面有上皮样细胞覆盖。术后2周，仅50%的腔面为上皮样细胞所覆盖；术后4-8周，腔面上皮覆盖率约70%，上皮层较前增厚；腔面上皮样细胞分布不均匀，部分腔面细胞成团，部分腔面上皮样细胞缺如，而且细胞分层不明显(图2)，未能形成完整的黏膜层。免疫组化染色提示上皮样细胞cytokeratin 7染色阳性(图3)，说明这些细胞是尿路上皮细胞。图1  通过双联注射器将细胞悬液喷涂于去黏膜胃片

 
　　3  讨    论

    用来重建或扩大膀胱的材料除了胃肠道，还有生物合成材料，如Polyglactin，聚乙烯海绵和Teflon等，这些材料由于异物反应的原因，效果并不理想[46]；也有学者尝试天然材料如筋膜和硬膜等[7]，小面积的这些材料可以由周围血管长入而血管化，但大面积的材料通常会发生中央坏死，吸收或挛缩等。

    在皮肤和黏膜缺损的重建和修复中，由单个细胞生长至成片的细胞片耗时较长；而将生长成片的细胞片移植至创面时其接纳情况又不可预料；更为重要的是，已融合成片的细胞与未融合的细胞相比，其传代后的细胞克隆形成率显著降低[8]。因此，未融合的单个细胞移植与移植成片的细胞膜片相比更为可取。目前已有通过将细胞悬于纤维蛋白凝胶而修复皮肤[9]和黏膜[10]缺损的报道。

    Hafez等[11]通过纤维蛋白凝胶将体外分离的膀胱平滑肌细胞和上皮细胞喷涂于去黏膜的结肠段，成功将结肠改造为尿路上皮细胞覆盖的新膀胱；Schoeller等[12]也通过该法将制成囊状的骨骼肌瓣成功改造为有尿路上皮覆盖的新膀胱。本实验中对照组新膀胱完全纤维化，无上皮细胞存在；实验组新膀胱随时间延长有不同程度的挛缩，无胃黏膜再生，4周后新膀胱的大部分腔面为尿路上皮所覆盖。纤维蛋白凝胶(fibrin glue, FG)的主要成分是纤维连接蛋白和纤维蛋白原。有资料显示，在缺乏纤维连接蛋白的情况下，FG可以抑制角化细胞的复制[13]；而凝血酶(FG的另一成分)在其他成分缺失时，可以促进上皮细胞生长，而且呈剂量依赖性[14]。

    纤维连接蛋白不仅帮助细胞附着于体内组织，还促进生长因子的渗透，而且其本身就是一种营养物质[15]，这在体内组织液通过渗透作用给细胞提供滋养以前是至关重要的。尽管接种的细胞在胃片腔面自然分层排列，或呈集落样生长，但它们并没有在腔面均匀地生长，从而形成一层黏膜。这些可能与呈集落生长的细胞没有与原始尿道接触有关[12]。本试验所使用的纤维蛋白凝胶成分为：fibrinogen(50-75mg/mL)，factor ⅩⅢ(10-50u/mL)，thrombin(400IU/mL)，CaCl2(40mmol/L)；与Schoeller T等人所采用的有较大差异(不含纤维连接蛋白但凝血酶含量较高)。因此本试验中尿路上皮细胞在体内生长缓慢，且细胞分层不明显，或许与其成分不同有关。此外，本试验中新膀胱都有不同程度的挛缩。Lima等[16]认为用来扩大或重建膀胱的去黏膜的肠管难免会发生挛缩，但术后若在新膀胱内放置气囊则可在很大程度上减轻，甚至避免。本试验中随时间延长实验组新膀胱挛缩，可能与没有放置气囊支撑物或尿液充盈有关。

    总之，本试验以纤维蛋白凝胶为载体构建组织工程胃新膀胱的动物模型中，尽管新膀胱上皮生长不均匀、黏膜未完全形成，但通过适当改进，如调整纤维蛋白凝胶的成分，或在术后于新膀胱内放置气囊支架，或许可以获得黏膜更完整、均匀且无明显挛缩的新膀胱。

【参考文献】
  [1]Greenwell TJ, Venn SN, Mundy AR. Augmentation cystoplasty [J]. BJU Int, 2001 (88):511525.

[2]Comer MT, Thomas DF, Trejdosiewicz LK, et al. Reconstruction of the urinary bladder by autoaugmentation, enterocystoplasty, and composite enterocystoplasty [J]. Adv Exp Med Biol, 1999 (462):4347.

[3]Southgate J, Cross W, Eardley I, et al. Bladder reconstruction—from cells to materials [J]. Proc Inst Mech Eng (H), 2003 (217):311316.

[4]Tsuji I, Kuroda K, Fujieda J, et al. Clinical experiences of bladder reconstruction using preserved bladder and gelatin sponge bladder in the case of bladder cancer [J]. J Urol, 1967 (98):9192.

[5]Kelami A, Dustmann HO, LudtkeHandjery A, et al. Experimental investigations of bladder regeneration using Teflonfelt as a bladderwall substitute [J]. J Urol, 1970 (104):693698.

[6]Kudish HG. The use of polyvinyl sponge for experimental cystoplasty [J]. J Urol, 1957 (78):232234.

[7]Kelami A. Lyophilized human dura as a bladderwall substitute: experimental and clinical results [J]. J Urol, 1971 (105):518522.

[8]Harris PA, Leigh IM, Navsaria HA. Preconfluent keratinocyte grafting: the future for cultured skin replacements [J]? Burns, 1998 (24):591593.

[9]Navarro FA, Stoner ML, Park CS, et al. Sprayed keratinocyte suspensions accelerate epidermal coverage in a porcine microwound model [J]. J Burn Care Rehabil, 2000 (21):513518.

[10]Yucel EA, Oral O, Olgac V, et al. Effects of fibrin glue on wound healing in oral cavity [J]. J Dent, 2003, 31(8):569575.

[11]Hafez AT, Afshar K, Bagli DJ, et al. Aerosol transfer of bladder urothelial and smooth muscle cells onto demucosalized colonic segments for porcine bladder augmentation in vivo: a 6week experimental study [J]. J Urol, 2005, 174(4):16631667.

[12]Thomas Schoeller, Neumeister MW, Huemer GM, et al. Capsule induction technique in a rat model for bladder wall replacement: an overview [J]. Biomaterials, 2004 (25):16631673.

[13]Weiss E, Yamaguchi Y, Falabella A, et al. Uncrosslinked fibrin substrates inhibit keratinocyte spreading and replication: correction with fibronectin and factor XIII crosslinking [J]. J Cell Physiol, 1998 (174):5865.

[14]Derian CK, Eckardt AJ, AndradeGordon P. Differential regulation of human keratinocyte growth and differentiation by a novel family of proteaseactivated receptors [J]. Cell Growth Differ, 1997, 8(7):743749.

[15]ParsonWingerter P, Sage EE. Regulation of cell behavior by extracellular proteins [M]// Lanza R, Langer R, Chick W, eds. Principles of Tissue Engineering. San Diego: Landes Company and Academic Press, 1997:111131.

[16]Lima SV, Araujo LA, Vilar FO, et al. Experience with demucosalized ileum for bladder augmentation [J]. BJU Int, 2001 (88):762764.

作者单位：(广东省人民医院泌尿外科，广东广州 510100)