肾癌患者外周血中survivin mRNA的表达

【关键词】  肾癌；RTPCR；survivin mRNA

　 肿瘤的浸润与转移是恶性肿瘤的重要特征，也是恶性肿瘤患者死亡的重要因素。肾细胞癌是成人肾脏最常见的恶性肿瘤。近1/3的肾细胞癌患者在诊断原发肿瘤时已有转移灶，另外约40%的患者术后一年内出现复发、转移。肾细胞癌一旦转移，5年生存率<10%，平均存活时间不到2年。未接受治疗者的3年存活率<5%。因此寻找敏感、特异的检测方法和肿瘤转移指标以明确肿瘤有无转移对临床诊断、治疗及预后判断具有重要的临床意义。近年来，RTPCR 法以其很高的灵敏性，被广泛用于各种实体瘤微转移(micrometastasis)的检测[12 ]。本研究应用RTPCR检测了肾细胞癌患者外周血中survivin mRNA的表达,初步探讨其在肾细胞癌微转移中的意义。

    1  资料与方法

    1.1  临床资料  收集兰州大学第二医院泌尿外科2004年12月-2005年8月经病理证实的肾透明细胞癌患者外周血标本共30例。男19例，女11例，年龄48-76岁，平均57岁。病理分级按WHO标准：Ⅰ级8例、Ⅱ级15例、Ⅲ级7例。临床分期按Robson标准：Ⅰ-Ⅱ 16例、Ⅲ-Ⅳ 14例。所有患者取血前均未进行手术、化疗或放疗。同时取10例健康志愿者外周血作为正常对照。

    1.2  主要材料  RNA提取试剂Trizol、DNA Marker、琼脂糖均购自北京天为时代科技有限公司。RTPCR试剂盒为Takara公司产品。survivin mRNA引物参考文献[3]设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。survivin mRNA上游引物序列为：5′GGACCACCGCATCTCTACAT3′，下游引物序列为：5′GCACTTTCTTCGCAGTTTCC3′；扩增目的片段长度为350bp。对照引物序列为：5CTGCTCGCTTCGCTACTTGGA3(上游)，5CGGCACCTGTCCTAGGAGTTG3(下游)；扩增片段长度为462bp。

    1.3  方法  抽取5mL外周血，EDTA抗凝，严格无菌操作，防止污染。采用淋巴细胞分离液，按密度梯度离心法，提取单个核细胞层(PMNC)。按Trizol总RNA提取试剂说明提取总RNA。UV9200型分光光度计测定RNA的浓度和纯度，同时进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，确定RNA的完整性。按照Takara公司One Step RNA PCR Kit(AMV)试剂盒说明进行RTPCR。总反应体系50μL：10×One Step RNA PCR Buffer 5μL，MgCl2(25mmol/L)10μL，dNTP Mixture(10mmol/L)5μL，Rnase Inhibitor(40u/μL)1μL，AMV Rtase XL(5u/μL)1μL，AMVOptimized Taq(5u/μL)1μL，上游和下游引物各1μL，RNA样品1μL，无核酶水24μL。反复吹吸混匀，具体反应条件：反转录50℃ 30min；反转录酶变性94℃ 2min；然后94℃ 30s、54℃ 30s、72℃ 60s，共30次循环扩增。PCR产物用25g/L(2.5%)琼脂糖凝胶电泳，以DNA Marker(100bp ladder)作为分子量标志，溴乙锭(EB)显色。

    1.4  统计学方法  采用SPSS11.5统计分析软件。采用χ2和Fisher 检验，P<0.05为差异有统计学有意义。

    2  结    果

    2.1  总RNA鉴定  按1OD=33μg RNA的标准，外周血中提取总RNA的产量约为8-10μg；A260/A280的比值为1.80-1.90，说明RNA提取物纯度较高，完全可以满足RTPCR需要。1%(体积分数)甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，EB染色可见28S、18S两条亮带(图1)，说明无RNA降解。

    图1   肾癌患者外周血RNA琼脂糖凝胶电泳结果

    1、2、4、5为阴性，第3泳道清晰显示28S、18S两条带

    2.2  PCR检测结果  30例肾透明细胞癌患者外周血中有23 例survivin mRNA阳性，阳性率为76.7%；10例正常健康人外周血中survivin mRNA表达均为阴性。两者的表达差异有统计学意义(P<0.001)。RTPCR电泳结果见图2。

    图2   肾细胞癌患者外周血survivin mRNA检测结果

    M: DNA Markers; 1: 阳性对照(462bp); 2, 3: survivin mRNA表达阳性 (350bp); 4: survivin mRNA表达阴性

    2.3  外周血survivin mRNA阳性检出率与病理学分级的关系  肾透明细胞癌组中外周血survivin mRNA阳性表达23例，其中Ⅰ级5例(62.5%)、Ⅱ级12例(80%)、Ⅲ级6例(85.7%)。随肿瘤组织分化程度的降低，survivin mRNA阳性率有增加的趋势，但差异无统计学意义(Fisher检验，P>0.05)。

    2.4  外周血Survivin mRNA阳性检出率与肾癌临床分期的关系  Survivin mRNA的表达随着临床病理分期的增高而增强，Ⅰ-Ⅱ期9例，阳性率为56.3%，Ⅲ-Ⅳ期14例，阳性率为100%；两者间比较差异有统计学意义(P<0.05)。

    3  讨    论

    肿瘤的浸润和转移是影响肿瘤患者预后的重要因素，而肿瘤的转移大多通过淋巴及血液循环播散。非血液系统的恶性肿瘤在发展过程中，肿瘤细胞播散并存活于淋巴系统、血循环、骨髓等组织器官中的微小肿瘤灶，常无任何临床表现，这称为微转移[1]。血液中存在瘤细胞并不意味一定就会发生转移瘤，但肿瘤细胞进入血液是肿瘤发生远处转移的先决条件[4]。提高肿瘤转移灶的早期检出率，可以降低恶性肿瘤的死亡率。作为评估肿瘤患者预后的监控指标。成功地进行肿瘤微转移的诊断取决于适当的肿瘤标志物和敏感的检测手段。

    检测肿瘤微转移的方法很多，如细胞形态学、流式细胞仪、细胞遗传学、免疫细胞化学、免疫组织化学等,但效果并不理想[56]。直至20世纪80年代后期,高灵敏度 PCR方法的出现使得检测循环肿瘤细胞及微小残余病灶的存在再次成为可能。而RTPCR技术是在PCR基础上发展起来的基因诊断方法，可快速扩增特异基因和DNA片段,可检测出106-107个正常细胞中的一个肿瘤细胞，是一种非常敏感的检测方法[7]。随着分子生物学技术的飞速发展，运用RTPCR检测患者外周血中某些特异性基因的表达已成为判断有无异位肿瘤细胞存在的一种重要手段[8]。

    肿瘤标志物包括传统的大分子标志物(主要是大分子蛋白质)和基因标志物，大分子蛋白质以抗体为基础进行IHS或蛋白质印迹(Western blot)检测；基因标志物主要用RTPCR检测。目前针对肿瘤检测的标志物主要有2类：一是肿瘤特异性标志物，指肿瘤细胞所特有的抗原或基因，特点是特异性强，但大多数实体瘤缺乏特异性肿瘤标志物，目前多处于研究阶段，因而临床上很难实际应用。二是组织特异性标志物，指肿瘤细胞的某种成分或表达产物在不同组织中有差异的分布，即通过检测某些上皮或肿瘤相关基因的表达，如CK、AFP、CEA、端粒酶等作为判断癌细胞存在的依据，特点是敏感性高，有一定的特异性，可以稳定地被检测到，易于临床上广泛应用，但特异性仍不够满意，容易出现假阳性。所以选择合适的标志物对提高微转移的检出率很有意义。

    Survivin基因是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins, IAP)家族的新成员，1997年由耶鲁大学的Altier等[9]利用效应细胞蛋白酶受体1(effector cell protease receotor1, EPR1)cDNA在人类基因组文库中通过杂交筛选并分离出来。人类survivin基因位于染色体17q25区，序列全长14.7kb，其mRNA包含4个外显子和3个内含子，编码蛋白长度大约142个氨基酸，分子量为16.5kD。survivin主要表达于胚胎组织和大多数肿瘤组织，而不见于终末分化的成熟组织[9]。研究表明，survivin的组织分布具有明显的细胞选择性——肿瘤特异性，并且在细胞中的表达具有严格的细胞周期依赖性——G2/M期特异性表达。基于survivin基因在正常组织中不表达，而在肿瘤发生的早期往往能够检测的这一特性，因此可用于肿瘤发生的早期诊断。多方面研究提示survivin可能是一种癌基因，参与肿瘤的发生发展，是一个具有潜在价值的肿瘤标志物。虽然survivin对于肾癌不具有组织特异性，但有着肿瘤特异性，因此检测肾癌患者外周血中survivin mRNA的表达，可以明确肿瘤有无转移，对手术选择术式及清扫范围，确定术前、术后治疗方案，减少肿瘤的转移和复发将起到重要作用，从而为临床的诊断、治疗带来根本变化。

    本研究采用RTPCR方法检测了30例肾细胞癌患者外周血中survivin mRNA的表达，其阳性率为76.7%，与正常健康人0%相比其差异具有统计学意义。survivin mRNA的表达随肿瘤组织分化程度的降低,阳性率有增加的趋势,但各组间比较差异无统计学意义，可能与病例数少及组间分配不平衡有关。但随着临床病理分期的提高,外周血中survivin mRNA的阳性率有显著上升趋势，各组间比较差异有统计学意义。同时我们注意到有明确转移病灶存在(包括血道转移)的晚期患者(Robson Ⅲ、Ⅳ期)外周血中survivin mRNA的阳性率为100%，明显高于早期肾癌患者(RobsonⅠ、Ⅱ期)56.3%，说明该方法是可靠的。因此我们认为RTPCR方法可以作为肿瘤微转移检测的敏感手段[7]，survivin可以作为肿瘤标记物用于肿瘤微转移的检测。

    微转移是出现转移灶的早期阶段。微转移的转归取决于癌细胞的生物学特性、机体的免疫状态及与宿主器官微环境之间的相互作用。血液中即使检测到循环肿瘤细胞，但并不一定可致显著的临床转移灶的发生。Glaves等对10例肾细胞癌的观察发现，每例术前释入肾静脉的癌细胞数高达109，而只有3例最终形成转移。尽管如此，血液中循环肿瘤细胞或微转移灶的存在毕竟增加了恶性肿瘤转移的风险。Azuhata[10]研究表明，survivin 的阳性表达是肾肿瘤复发的高危因素且提示预后不良。检测外周血中survivin mRNA可作为肿瘤微转移的一个监测指标，将有助于肿瘤的早期诊断和预后的评估，确定患者术后复发的危险性，指导选择正确的治疗方案。

【参考文献】
  \[1\]Raj GV, Moreno JG, Gomella LG. Utilization of polymerase chain reaction technology in the detection of solid tumors \[J\]. Cancer, 1998, 82(8):14191442

\[2\]Zach O, Kasparu H, Krieger O, et al. Detection of circulatingmammary carcinoma cells in the peripheral blood of breast cancerpatients via a nested reverse transcriptase polymerase chain reaction assay for mammaglobin mRNA \[J\]. J Clin Oncol, 1999, 17(7):2015

\[3\]Sarela AI, Macadam RCA, Farmery SM, et al. Expression of the antiapoptosis gene, survivin, predicts death from recurrent colorectal carcinoma \[J\]. Gut, 2000, 46(5):645650.

\[4\]Kohn EC, Liotta LA. Molecular insight into cancer invasion: Strategies for prevention and intervention \[J\]. Cancer Res, 1995, 55(9):18561862.

\[5\]Yamaguchi K, Takagi Y, Aoki S, et al. Significant detection of circulating cancer cells in the blood by reverse transcriptasepolymerase chain reaction during colorectal cancer resection \[J\]. Ann Surg, 2000, 232(6):5865.

\[6\]Soria JC, Gauthier LR, Raymond E, et al. Molecular detection of telomerase positive circulating epithelial cells in metastasis breast cancer patients \[J\]. Clin Cancer Res, 1999, 5(3):971975.

\[7\]Ghossein RA, Bhattacharya S, Rosai J. Molecular detection of micrometastasis and circulating tumor cells in solid tumors \[J\]. Clin Cancer Res, 1999, 5(7):19501960.

\[8\]Ghossein RA, Rosai J. Polymerase chain reaction in the detection of micrometastasis and circulating tumor cells \[J\]. Cancer, 1996,78(12):1016.

\[9\]Ambrosini G, Adida C, Altieri DC. A novel antiapoptosis gene, Survivin, expressed in cancer and lymphoma \[J\]. Nat Med, 1997, 3(8): 917921.

\[10\]Azuhata T, Scott D, Takamizawa S, et al. The inhibitor of apoptosis protein is associated with highrisk behavior of neuroblastma \[J\]. J Pediatr Surg, 2001, 36(12):17851791.

作者单位：兰州大学第二医院泌尿外科，甘肃兰州 730030