尿脱落细胞端粒酶催化亚基mRNA检测在膀胱癌诊断和监测复发中的意义

【摘要】  目的 探讨尿脱落细胞端粒酶催化亚基(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)mRNA检测在膀胱癌早期诊断和监测复发中的应用价值。方法 采用逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptase PCR, RT-PCR)检测42例膀胱癌、38例膀胱良性疾病患者和12例健康体检者晨尿中脱落细胞hTERT mRNA的表达，并与尿脱落细胞学检查结果比较；随访观察其中37例膀胱癌术后尿液hTERT mRNA变化与复发的关系。结果 hTERT检测膀胱癌的敏感性为97.62%，显著高于尿脱落细胞学检测的61.9%(P<0.05)；特异性为96%，与尿脱落细胞学检测98%无明显差异(P>0.05)；膀胱癌患者术前hTERT mRNA表达强度明显高于膀胱良性疾病患者和对照组(P<0.05)；且随肿瘤恶性程度的增加逐渐升高，G1、G2、G3(WHO分级)患者hTERTmRNA表达强度分别为0.63±0.14、0.75±0.16、0.87±0.20。结论 尿脱落细胞hTERT mRNA检测具有高度敏感和特异性，对膀胱癌早期诊断、疗效评估和术后监测复发具有重要的临床应用价值。

【关键词】  膀胱癌；端粒酶催化亚基；尿脱落细胞；逆转录聚合酶链反应

     膀胱癌是泌尿系统最常见、易复发的肿瘤，目前缺乏理想的无创性早期诊断、监测复发的方法。我们采用逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptase PCR, RT-PCR)检测端粒酶催化亚基(human telomerase reverse transcriptase, hTERT) mRNA在膀胱癌患者、膀胱良性疾病患者和健康者尿脱落细胞中的表达，并与尿脱落细胞学检查结果对比，探讨其在膀胱癌早期诊断和监测复发中的应用价值。

    1  资料与方法

    1.1  临床资料  膀胱癌患者42例，来自2004年3月至2005年9月于湖北老河口市第一医院和华中科技大学同济医学院附属协和医院就诊患者，男24例，女18例，年龄34-75岁，均经病理检查确诊为膀胱移行细胞癌，根据WHO分级标准，其中G1 13例，G2 19例，G3 10例。膀胱良性疾病患者38例，来自上述两所医院，男26例，女12例，年龄25-76岁，包括良性前列腺增生症12例，腺性膀胱炎11例，膀胱乳头状瘤8例，膀胱结石7例。健康对照12例，来自健康体检者，男7例，女5例，年龄18-31岁。

    1.2  主要仪器和试剂  PCR仪(Biometram)购自德国Biotron公司，紫外分光仪(GeneQuant)购自美国Beckman公司，凝胶成像系统GDS8000型购自英国UVP公司。Trizol试剂和AMV逆转录酶购自美国promega公司。hTERT引物序列参考文献［1］，上游引物：5′-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3′, 下游引物：5′-GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3′；β-actin上游引物：5′-ACACTGTGGCCATCTACGAGGGG-3′,

    下游引物：5′-ATGATGGAGTTGAAGGTAGTTT-

    CGTGGAT-3′；均由上海Sangon生物工程公司合成。TaqDNA聚合酶购自武汉大风生物科技有限公司。

    1.3  方法

    1.3.1  标本收集和制备  留取受试者清晨第一次中、后段尿液，静置，弃上清，离心，生理盐水洗涤，取少许沉渣涂片行细胞学检查，余沉渣备总RNA的提取。

    1.3.2  总RNA提取  严格按Trizol说明从尿沉渣脱落细胞中提取总RNA，用紫外分光仪检测A260/A280比值，计算总RNA纯度。

    1.3.3  RT-PCR  用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA。逆转录制备cDNA，总反应体系20 μL，按顺序加DEPC处理水、5×Buffer 4 μL、2.5 mmol/L dNTP 4 μL、oligo (dT18)50 pmol、Rnasin(40 U/μL)0.5 μL、总RNA 2 μg、AMV逆转录酶(9 U/L)1 μL，37 ℃反应1 h，99 ℃ 5 min终止反应，-20 ℃保存。PCR反应体系50 μL，包括等量逆转录反应产物4μL，β-actin及hTERT的寡核苷酸引物5 pmol，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，10×PCR反应缓冲液5 μL，Taq DNA聚合酶1.5 U，PCR循环参数为94 ℃ 45 s，57 ℃ 45 s，74 ℃ 60 s，35个循环。阴性对照中以灭菌水代替cDNA。2.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定分析PCR扩增产物。hTERT产物长度145 bp。β-actin反应体系与hTERT同管进行，产物长度208 bp。凝胶分析软件计算目的条带灰度值。

    1.3.4  尿脱落细胞学检查  采用瑞氏-姬姆萨复合染色法，以正常膀胱移行细胞形态对照。病理分级标准(WHO)：核染色质粗糙、结构混乱，胞质灰蓝色，核膜厚为G1；细胞增大且形态多样，核/质比例增大，核染色质粗索状、粒状或网状，核染色深，胞质嗜碱性为G2；核巨大、形状不一，胞质少许，嗜碱性，核染色质浓密为G3。

    1.3.5  统计学分析  实验数据采用x±s表示，率比较采用χ2检验，两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用q检验，α=0.05为检验水准。采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。

    2  结    果

    42例膀胱癌患者尿脱落细胞中41例检出hTERT基因145 bp条带，阳性检出率97.62%；38例泌尿系良性疾病和12例健康体检者尿液标本中仅1例膀胱乳头状瘤患者表达阳性，阴性检出率96%。G1、G2、G3膀胱癌患者尿脱落细胞中hTERT平均灰度值分别为0.63±0.14、0.75±0.16、0.87±0.20。膀胱良性疾病与膀胱癌患者之间尿脱落细胞中hTERT平均灰度值差异有统计学意义(P<0.05)，hTERT平均灰度值随膀胱癌分级增加而升高(图1)，各级间hTERT平均灰度值差异有统计学意义(P<0.05)。hTERT检测膀胱癌的敏感性为97.62%(41/42)，显著高于尿脱落细胞学检测的61.9%(26/42)，P值<0.05，特异性为96%(48/50)与尿脱落细胞学检测的98%(49/50)无明显差异(P>0.05)。动态监测其中37例膀胱癌术后患者尿液hTERT mRNA表达强度(表1)。表1  膀胱癌患者尿液hTERT mRNA表达强度动态变化

    3  讨    论

    端粒酶是近年来研究较多的肿瘤标记物之一，目前普遍认为端粒酶的激活与肿瘤发生、发展密切相关。绝大部分恶性肿瘤组织均有明显的端粒酶活性，而正常细胞、部分良性肿瘤组织和非永生细胞系中则无或仅有极低的端粒酶活性［2］。端粒酶由端粒RNA亚基(human telomerase RNA, hTR)、端粒酶相关蛋白及具有逆转录酶活性的端粒酶催化亚基(hTERT)三部分组成，前二者在组织中表达广泛，而hTERT仅在肿瘤组织中表达。hTERT基因位于5p15.33，长度约为40 kb，分子质量为127 ku的核蛋白，其功能是催化激活端粒酶，在调节端粒酶活性中起关键作用。检测hTERT比端粒酶活性具有更高的特异性和灵敏度［3］。研究表明，膀胱癌早期和进展期均存在hTERT 基因异常表达，其表达强弱与肿瘤分化和进展有关，有复发倾向的病例比没有复发的病例高［4］，且膀胱癌细胞中端粒酶活性能够被茶多酚抑制，从而导致肿瘤细胞的端粒缩短，诱导肿瘤细胞凋亡［5］。

    本实验结果发现，几乎所有膀胱癌患者尿脱落细胞中均有hTERT异常表达，且其表达强度随着膀胱癌分级增加而增强，而健康者不表达hTERT，膀胱良性疾病只有较少及弱的hTERT表达，动态监测膀胱癌患者术后hTERT表达强度发现有复发倾向的患者其表达强度逐渐增强，提示hTERT可能在膀胱癌的发生、发展中发挥重要调节作用，hTERT可作为早期诊断膀胱癌和监测其复发的重要生物学指标。用人RT-PCR扩增尿脱落细胞中mRNA的可靠程度较高，即使在微量mRNA模板条件下，仍能扩增出目的片段［6］。采用RT-PCR检测尿脱落细胞hTERT mRNA对诊断膀胱癌具有与传统尿液脱落细胞学检查同样的特异性，而且更敏感，这与文献［7］报道相似。但由于尿脱落细胞中癌细胞及其RNA 含量有限，即使在-70 ℃条件下，也会渐渐降解［6］，并且提取过程中经反复洗涤和抽提，RNA丢失量较多，可出现假阴性结果，本组就有1例为假阴性。因此，如何获得完整的高质量的RNA是检测成功的关键，最好在获得新鲜尿液标本后立即提取RNA，并将其中的mRNA逆转录成cDNA，而不应将标本冷冻后再用。

    传统的膀胱镜和尿液细胞学检查是诊断膀胱癌及其术后随访最常用的方法，但前者有创伤，且难以发现微小及隐匿性病变；后者对低级别肿瘤的诊断缺乏敏感性。采用RT-PCR方法检测尿脱落细胞中hTERT mRNA表达水平，取材方便、无损伤、无痛苦、设备要求简单、实验结果快速，且具有高度敏感和特异性，对膀胱癌高危人群的筛选、早期诊断、疗效评估和术后监测复发具有重要的临床应用价值。

【参考文献】
  ［1］Nakamura TM, Morin GB, Chapman KB, et al. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human ［J］. Science, 1997, 277(5328):955-959.

［2］倪晓谦，奚伟红，沈玉琴, 等. 端粒酶活性与肿瘤相关性研究 ［J］. 中国临床医学, 2002, 9(6):627-629.

［3］杨绍波，李振华，王立忠，等. 尿液端粒酶活性在膀胱癌诊断和监测复发中的意义 ［J］. 中华泌尿外科杂志, 2002, 23(3):164-166.

［4］符伟军，邵国兴，姜彦多，等. 端粒酶逆转录酶基因hTERT在膀胱移行细胞癌组织中的表达意义 ［J］. 第四军医大学学报, 2001, 22(15):1412-1415.

［5］王田，邱学德，黄杰, 等. 茶多酚对膀胱肿瘤细胞端粒酶活性的影响 ［J］. 现代泌尿外科杂志, 2005, 10(6):314-316.

［6］吴忠，张元芳，刘定干，等. 从膀胱癌尿脱落细胞中提取RNA进行RT-PCR的研究 ［J］. 中华实验外科杂志, 1997, 14(5):287-289.

［7］Melissourgos N, Kastrinakis N, Davilas I, et al. Detection of human telomerase reverse transcriptase mRNA in urine of patients with bladder cancer: evaluation of an emerging tumor marker ［J］. Urology, 2003, 62(2):362-367.

作者单位：老河口市第一医院泌尿外科，湖北老河口 441800