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【摘要】 目的 探讨膀胱移行细胞癌组织中凋亡抑制蛋白survivin和环氧化酶-2(cox-2)的表达与肿瘤生物学行为之间的关系及其二者的相关性。方法 应用免疫组化Envision法，检测42例膀胱移行细胞癌组织标本和10例非肿瘤正常膀胱组织(正常对照组)中survivin和cox-2的表达。结果 42例膀胱移行细胞癌组织中survivin和cox-2表达的阳性率分别为78.6%和81.0%，正常对照组中均未见表达；survivin表达强度与肿瘤分期及复发呈正相关关系(P<0.05)，而与肿瘤分级无关(P>0.05)；cox-2表达强度与肿瘤分级和分期呈正相关关系(P<0.05)，而与肿瘤复发无关(P>0.05)；survivin和cox-2在膀胱移行细胞癌中的表达密切相关(rs＝0.327,P<0.05)。二者的表达与患者的性别、年龄、术时肿瘤的大小、数目及部位无关(P>0.05)。结论 Survivin和cox-2在膀胱移行细胞癌组织中普遍表达，且表达密切相关，二者可能在膀胱癌的发生、发展过程中起重要作用，并与浸润关系密切。
【关键词】 膀胱癌；移行细胞；survivin；环氧化酶-2；免疫组织化学
survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor apoptosis protein, IAP)家族的成员,是目前已知最强的抑制凋亡因子。主要通过抑制半胱天冬蛋白酶3(caspase-3)和半胱天冬蛋白酶7(caspase-7)的活性而抑制细胞凋亡［1］。环氧化酶-2(cyclooxygenase-2, cox-2)为诱导酶,生理状态下多数细胞中不存在,只有在细胞受到炎症刺激、组织损伤或细胞恶性转化时表达增强，且与肿瘤的浸润、转移、细胞凋亡等特性有关。本文探讨survivin和cox-2在膀胱移行细胞癌中的表达和临床病理特征之间的关系及二者的相关性。
1 材料与方法
1.1 一般材料 收集新乡医学院第一附属医院2002年3月-2004年8月归档膀胱移行细胞癌手术切除石蜡标本42例，均经病理科资深医师核实。病理分级Ⅰ级15例，Ⅱ级17例，Ⅲ级10例；临床分期Tis-T1期15例，T2-T4期27例；男性34例，女性8例，年龄35-93岁，平均62岁；原发肿瘤29例，复发13例；术时肿瘤直径小于3 cm者27例，大于等于3 cm者15例；术时肿瘤部位(肿瘤多发者按相应部位计入)左侧壁19例，右侧壁17例，顶壁10例，膀胱底、颈及三角区9例；术时可视肿瘤单发者28例，多发14例；临床病历资料均完整。另取10例膀胱部分切除之正常膀胱黏膜为正常对照。
1.2 主要试剂 survivin兔抗人多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)；cox-2鼠抗人单克隆抗体、通用型Envision试剂盒PV-6000、显色剂DAB均购自北京中山生物技术有限公司。
1.3 方法 采用免疫组化Envision法，严格按照Envision试剂盒所附说明书进行操作。一抗cox-2为工作液可直接滴加，survivin稀释至1∶100。切片常规脱蜡至水，3%(体积分数)H2O2室温封闭10 min，微波抗原修复，10%(体积分数)羊血清室温孵育15 min，分别滴加cox-2、survivin一抗，Envision试剂盒A液、B液，DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片，PBS替代一抗作阴性对照。
1.4 结果判定标准 采用双人双盲随机阅片，对染色结果进行定性和半定量分析。survivin染色阳性以胞核和胞浆内出现棕色颗粒，cox-2染色阳性以细胞胞浆内出现棕色颗粒为准。判定方法［2］：在400倍光镜下至少观察5个视野，根据免疫组化染色强度及阳性细胞数量进行半定量评分，分别记0-3分，其中染色强度以多数细胞呈色反应为准。不着色为0分，浅棕黄色为1分，棕黄色为2分，深褐色为3分。阳性细胞数＜10%记为0分，10%-45%为1分，46%-65%为2分，>65%为3分。染色强度及阳性细胞数得分相乘，0为阴性(-)，1-2分为弱阳性(+)，3-4分为阳性()，5-6分为强阳性()。
1.5 统计学处理 组间率的差异用χ2检验，不满足χ2检验条件时用Fishers确切概率法；等级资料的相关性分析用Spearman等级相关。检验水准均为α=0.05，使用SPSS10.0统计软件完成。
2 结 果
2.1 免疫组化染色结果 survivin蛋白染色主要表达于癌细胞胞核内(图1A)，高分级时可见核、浆共染甚至胞膜着色(图1B)，胞核内棕色颗粒呈均匀性分布或点片状浓集。cox-2蛋白染色表达于癌细胞胞浆，部分以核周为著，胞浆内棕色颗粒可呈均匀性分布或团块状局部浓集，色度较深(图1C、D)。正常对照组均未见染色。
图1 各组survivin及cox-2的表达 (Envision×200)
A：G2膀胱移行细胞癌中survivin的表达；B：G3膀胱移行细胞癌中survivin的表达；C：G2膀胱移行细胞癌中cox-2的表达；D：G3膀胱移行细胞癌中cox-2的表达
2.2 survivin和cox-2的表达与其他因素的关系 患者的性别、年龄、术时肿瘤的大小、数目及部位无关(P>0.05)。
2.3 survivin和cox-2在膀胱移行细胞癌和正常膀胱黏膜中的表达 见表1。
2.4 survivin和cox-2在膀胱移行细胞癌各分级中的表达 见表2。
2.5 survivin和cox-2的表达与膀胱移行细胞癌临床病理分期的关系 见表3。
2.6 survivin和cox-2在原发、复发膀胱移行细胞癌中的表达 见表4。
2.7 膀胱移行细胞癌中survivin和cox-2表达的相关性 见表5。表1 survivin和cox-2在膀胱移行细胞癌和正常膀胱黏膜中的表达表2 survivin和cox-2在膀胱移行细胞癌各分级中的表达表3 survivin和cox-2的表达与膀胱移行细胞癌临床病理分期的关系表4 survivin和cox-2在原、复发膀胱移行细胞癌中的表达 表5 膀胱移行细胞癌中survivin与cox-2表达的相关性
3 讨 论
膀胱移行细胞癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，约占膀胱上皮性肿瘤的90%以上，具有多源性和异质性两大特点。提高膀胱癌患者治疗效果和总体生存率的关键在于早期诊断，并根据其生物学特点采取合理有效的治疗并严密随访。由于survivin和cox-2在绝大多数人类恶性肿瘤中高表达，而在大多数正常组织中不表达或低表达，具有很好的敏感性和特异性，从而成为近年来肿瘤研究的热点。
3.1 survivin在膀胱移行细胞癌中的表达及意义 survivin是目前已知的最强的凋亡抑制因子，除了在甲状腺和胎盘中有微量表达外，在成人正常组织中均无表达，survivin mRNA和蛋白几乎在所有的人类癌症中都有表达，而在癌旁正常组织和成人分化成熟组织中并不表达。文献报道，survivin在不同肿瘤中的阳性表达率，由胃癌的35%到恶性黑色素瘤的93%不等，膀胱癌为57.8%-78%［3-4］，本研究为78.6%。目前，survivin免疫组化染色的细胞定位仍存在争议［5］。在不同的肿瘤组织中，survivin可表达于胞浆、胞核甚至胞浆、胞核均表达，在同一种肿瘤组织内亦可出现胞浆或胞核为主的不同表达［6］。有相关报道显示，survivin的核表达往往提示较好的生存期和预后［7-10］。本实验survivin的表达主要定位于胞核，仅在Ⅲ级膀胱移行细胞癌中出现了核浆共染和胞膜着色的情况，但出现胞浆的染色与肿瘤恶性程度的增高和不良预后的关系，尚需进一步的实验证实。本实验显示，survivin的表达程度与膀胱移行细胞癌的临床分期和复发呈正相关，而与肿瘤的分级无关；提示survivin的表达水平随肿瘤浸润深度的增加和复发次数的增多而增高，是监测肿瘤浸润和复发的良好指标。在肿瘤细胞的不同恶性程度间其表达程度无明显差异，尚不能以其表达水平来判断肿瘤细胞的恶性程度。
3.2 cox-2在膀胱移行细胞癌中的表达及意义 cox又称为前列腺素(PGs)内过氧化合成酶，是催化花生四烯酸转变为重要活性物质前列腺素的关键限速酶。哺乳动物的cox有两种同工酶cox-1和cox-2，cox-1属于结构型基因，在正常组织和细胞中表达，参与维持机体正常的生理机能。cox-2是一种诱导酶，一般只在诱导因子的作用下表达上调，这些诱导因子包括各种细胞因子、生长因子以及致癌物质等，在正常生理状态下多数组织内几乎检测不到。cox-2可通过诱导肿瘤血管的生成、增强浸润和转移、促进增殖、抑制凋亡及抑制肿瘤免疫等机制促进肿瘤发生发展［11］。本实验cox-2的表达率为81%，与文献报道相同。半定量分析显示，cox-2的表达程度与肿瘤的分级和分期呈正相关，而与肿瘤的复发关系不大。提示cox-2的表达水平随恶性程度和肿瘤浸润深度的增加而增高，是评价肿瘤恶性程度和侵袭性的良好指标。其表达程度在原复发癌中无明显差异，提示以其表达程度判断肿瘤的复发倾向证据不足。
3.3 膀胱移行细胞癌中survivin和cox-2表达的相关性及意义 survivin和cox-2在肿瘤发生发展中的重要作用，使得二者的关系成为近年来国内外学者探讨的热门课题。Dalwadi等［12］在对cox-2的研究中发现了一个新的通路，即cox-2可通过诱导IL-6的表达激活STAT3，而STAT3或IL-6的激活可抑制凋亡和增强survivin的表达，从而导致survivin依赖的凋亡抑制和VEGF的产生而形成肿瘤。Krysan等［13-14］的研究显示，survivin与cox-2的表达呈正相关关系，二者在人类非小细胞肺癌中常表达上调和共同表达。采用siRNA抑制survivin的表达可降低过度表达cox-2的非小细胞肺癌细胞株的凋亡抑制水平，认为非小细胞肺癌中cox-2依赖的survivin表达是凋亡抑制的关键。国内赵君宁在胃癌、刘江伟在胰腺癌、梁新军在骨肉瘤、魏欣在口腔鳞癌中都发现了survivin和cox-2表达的相关性。本组实验survivin和cox-2在膀胱移行细胞癌中的表达明显相关，survivin的表达程度随cox-2的表达程度而增高。推测二者可能具有共同的激活机制或调节通路，而在膀胱移行细胞癌发生发展中起到协同或序贯作用。cox-2的抗凋亡通路可能是通过上调survivin而实现的，但具体机制尚待进一步研究。本实验可望为以二者为靶点的基因诊断和治疗提供一定的依据。
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作者单位：华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科，湖北武汉 430030