重组人类精囊蛋白的制备及功能研究

【摘要】  目的 制备重组精囊蛋白(semenogelin, Sg)，研究其对精子活动的影响。方法 设计特异性的引物，用分子克隆技术从精囊cDNA文库中扩增精囊蛋白Sg，再将DNA插入质粒载体PET100，筛选序列正确的阳性克隆，转染BL21(DE3)大肠埃希菌，诱导表达重组人类Sg蛋白，用500 g/L Ni-NTA纯化重组蛋白，用正常人的通过上游法筛选出的活动精子行抑制分析，研究重组Sg在4种不同浓度0，1 ng/μL、5 ng/μL、10 ng/μL下对精子活动的影响。结果 重组Sg在5 ng/μL、10 ng/μL浓度下明显抑制精子的运动(P<0.001)。结论 Sg分子明显抑制精子运动，精液液化过程中，必须清除Sg中具有抑制功能的片段，精子才能前向运动。

【关键词】  精子活动；前列腺特异性抗原；重组技术；精囊蛋白

    射精后的人类精液自发性凝固成最初的胶冻状态，随后的精液液化过程中，前列腺来源的蛋白激酶分解精液中的抑制精子活动的凝固蛋白，从而释放精子的运动。引起精液凝固的蛋白质主要是来自精囊分泌的含量丰富的精囊蛋白(semenogelin, Sg)，Sg具有抑制精子活动的作用［1-2］，其相对分子质量为52 000，由精囊上皮细胞特异性分泌，在精囊中被蛋白C抑制剂(protein C inhibitor, PCI)保护，以防被其他蛋白酶分解。射精后，Sg与精子表面的附睾蛋白激酶抑制剂Eppin结合［3-4］，精液液化过程中，前列腺特异性抗原(prostate-specific antigen, PSA)将Sg分子中的抑制片段水解成许多相对分子质量<10 000的小片段，精子才能开始活动。从精液中分离的许多Sg的水解片段具有各种各样的生物活性［5］，认识不同的Sg分解片段对精子的影响，对调控精子的获能及受孕极为重要，也可为进一步认识精液液化的分子机制提供重要帮助。本文利用分子克隆技术体外重组人类精囊蛋白Sg，研究其对精子运动活性的抑制。

    1  材料与方法

    1.1  实验材料  本实验所用化学试剂和生物制剂均购自美国Sigma公司，PET-100质粒购自Invitrogen公司，质粒纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification)和聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)试剂盒购自美国Qiagen公司(Valencia, CA)，稳定素(P)购自Millipore公司(Bedford, MA)。

    1.2  重组Semenogelin蛋白的制备  在引物前端加上CACC碱基，以利于插入PET100载体，重组全长6-His-Semenogelin的引物：上游引物：5′-CACCGGTGGATCAAAAGGCCGATTACC-3′；下游引物：5′-CTATCGGCCATGCTGTTGATCTTG-3′。以精囊cDNA文库为模板扩增Sg。用Pfx Platinium多聚酶(Invitrogen, Calsbad, CS)，在94 ℃变性15 s，55 ℃复性30 s和68 ℃延伸1 min，共28个循环。为将PCR合成的DNA克隆到载体质粒PET100中，设置克隆反应体系，在Topo克隆反应中按照PCR产物DNA与Topo载体PET100分子比率0.5∶1到2∶1的比例加入，其组成：PCR产物4 μL，盐溶液1 μL，Pet-100载体1 μL，总量6 μL。轻轻混匀，常温孵育5 min，然后转染Top10 E.coli细胞。分析转染体，筛选阳性克隆，阳性克隆质粒基因序列均经DNA测序证实正确后，转染E.coli BL21，1 mmol/L IPTG诱导重组蛋白的表达。大量的蛋白以可溶的形式存在于胞浆中,重组蛋白的纯化用500 g/L Ni-NTA树脂，采用pH值从8.0至6.3的相同缓冲液(100 mmol/L NaH2PO4,10 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L Urea)先洗涤未与树脂结合的杂质，再用pH值4.5缓冲液将结合在树脂上的重组蛋白洗涤出来。重组Sg蛋白全长氨基酸片段为第24-283位氨基酸。纯化的重组蛋白均在pH7.0标准磷酸盐缓冲液(PBS)中透析24 h，恢复蛋白质的活性。

    1.3  Western印迹分析  重组Sg蛋白在10%-20%梯度凝胶(Bio-Rad)中电泳分离，或在4%-12%梯度NuPAGE Bis-Tris胶(Invitrogen)中进行，并转移到Immobilon-P(Millipore)膜上，转移膜用酰胺黑染色或用含30 g/L牛血清白蛋白的TBS缓冲液(50 mmol/L Tris，pH 7.4，150 mmol/L NaCl)在室温条件下封闭60 min，冲洗后加入1∶2 000稀释的一抗(兔抗人Sg S20H或鼠抗人MHS-5)在常温下孵育膜1 h，再用TBS缓冲液洗涤膜2次，加入碱性磷酸酶标记二抗(羊抗兔的IgG，1∶2 000稀释)，室温下孵育1 h，洗涤膜2次后用四唑硝基蓝-5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸(BCIP/NTP)染色观察结果。

    1.4  精子制备  由生殖医学门诊提供的正常人新鲜的精液，通过上游法筛选前向运动的精子，用精液洗涤剂M2和磷酸盐缓冲液去除精子表面的精浆成分。最后精子溶解在pH7.0的磷酸盐缓冲液中，在显微镜下计数。

    1.5  精子运动抑制试验分析  将纯化的重组人类全长Sg，按3种不同的浓度1 ng/μL，5 ng/μL和10 ng/μL分别与20份均含有1×106/mL活动精子的磷酸缓冲液100 μL孵育30 min，在显微镜下观察精子活动的变化。以不含Sg的磷酸盐缓冲液作为对照。

    1.6  统计学分析  测定结果以x±s表示，实验组和对照组用方差分析(F检验)，所有数据均用SAS统计软件处理。

    2  结    果

    2.1  扩增的全长Sg DNA  PCR扩增后的Sg DNA为772 bp，编码第24-283位氨基酸；N-Sg 414 bp，编码第24-163位氨基酸；C-Sg 354bp，编码第164-283位氨基酸。

    2.2  重组蛋白Sg24-283  从序列正确的阳性克隆转染BL21，诱导表达的重组蛋白经500 g/L Ni-NTA树脂纯化后，重组6-His全长Sg有较高的表达和纯度，经在磷酸盐缓冲液中透析后，变性的重组蛋白恢复其活性状态。取2 μg重组蛋白经100-200 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳后，Western印迹证实有较高纯度的重组蛋白转膜到PVDF印迹膜上。

    2.3  重组Sg抑制精子活性分析(表1)  加入5 ng/μL及10 ng/μL重组Sg使前向运动的精子停止运动(P<0.01)。1 ng/μL重组Sg使活动无明显影响(P<0.05)。对照组仅加入pH 7.0的磷酸缓冲液，观察30 min，对精子活动无明显影响(P>0.05)。表1  不同浓度的Sg抑制精子活动率的结果分析

    3  讨    论

    免疫组织化学表明［5-6］大量的Sg抗原特异性地分布在精囊上皮细胞的细胞浆中,射精后的人类精浆成凝固状态,起主要作用的成分就是精囊来源的Sg。正常人精浆中Sg含量4-68mg/mL,精子数量大于2×108/mL。本实验利用分子克隆技术体外重组出人类精囊蛋白Sg，观察在相同活动精子数量下不同浓度的Sg对精子活动的影响。发现随着Sg浓度的增加精子的活动率逐渐降低，在Sg浓度达到10 ng/μL时，精子的活动率降至为零。Robert和Gagnon［1-2］对Sg的功能进行详细的研究,认为Sg由精囊上皮细胞特异性分泌，在精囊中与PCI相互结合，受PCI保护，PCI具有抑制蛋白酶的活性，从而保护Sg免除其他蛋白酶分解。射精后的Sg是PSA的生理底物，PSA为前列腺上皮分泌的一种丝氨酸蛋白激酶，在前列腺液中以前体形式存在，且受高浓度Zn离子抑制而无活性。射精后，精囊中的Sg与前列腺分泌的Zn结合，释放PCI，由于Zn与Sg的结合，使Zn离子失去对PSA的抑制作用，加上精浆中的某些活性酶作用，使前体形式的PSA被激活。精液液化过程中,活化的PSA具有消化分解精浆中的凝集蛋白Sg的功能，从而释放许多分子量较小的Sg分解片段，解除Sg对精子活动的抑制，精子开始活动。

    体外研究分析表明射精后Sg163-283结合在精子表面的表面蛋白Eppin 75-133上［3-4］，通过对Sg的许多分解片段进一步分析，不同的氨基酸片段行使不同的功能，我们用重组Sg(氨基酸序列24-283)体外进行精子活动的抑制试验分析，发现精子活动受抑制，PSA必须清除Sg分子中具有抑制功能的片段，才能使精子获得前向运动和获能，PSA对Sg的切除几乎毫无例外地在分子结构的亮氨酸和酪氨酸残基的部位,从而释放一系列分子量较小的多肽片段,研究发现这些片段具有各种各样的生物学活性。有报道从精液中分离出的Sg N端的一些分解片段具有明显的抗菌活性［7］，Sg残基45-136氨基酸片段被认为具有抑制素样的活性［8］，残基350-374氨基酸肽段具有促甲状腺激素释放激素样的作用［9］。另外，Sg分子中某些肽段结合Zn，在精浆与精子膜表面进行着离子的传递，Zn被认为对精子核DNA结构的完整性和功能方面发挥着重要的作用［10］。显然Sg是精液凝固和液化过程中起中心作用的极为重要的精浆蛋白，Sg不同的分解片段，具有各种各样的生物活性，行使着不同的生理功能，调控着精子的进一步获能和运动，对Sg分子中不同片段的功能认识，能进一步了解精液液化的分子机制。由于Sg在精液凝固和液化过程中的重要作用，临床上，精液不液化使精子活动受限，减缓或抑制精子进入子宫腔受精而引起不孕症。精液粘稠度增高，将影响精子活力和存活率。因此，在精液中加入前列腺分泌的蛋白激酶，有助于凝固蛋白彻底水解,对治疗精液粘稠度增高导致的不孕可能有所帮助。

【参考文献】
  ［1］Robert M, Gagnon C. Purification and characterization of the active precursor of a human sperm motility inhibitor secreted by the seminal vesicles: identity with semenogelin ［J］. Biol Reprod,1996, 55(4):813-821.

［2］Robert M,Gagnon C.Semenogelin I: a coagulum forming, multifunctional seminal vesicle protein ［J］. Cell Mol Life Sci, 1999, 55(6-7):944-960.

［3］Wang ZJ, Widgren EE, O'Rand MG, et al. Association of eppin with semenogelin on human spermatozoa ［J］. Biol Reprod, 2005, 72(5):1064-1070.

［4］王增军,吴宏飞,钱立新，等. 人类精子表面附睾蛋白激酶抑制剂Eppin和精囊凝固蛋白Semenogelin的相互作用研究 ［J］. 中华男科学杂志,2006,12(5):428-434.

［5］Bjartell A, Malm J, Moller C, et al. Distribution and tissue expression of semenogelin I and II in man as demonstrated by in situ hybridization and immunocytochemistry ［J］. J Androl, 1996, 17(1):17-26.

［6］ORand MG, Widgren EE, Wang ZJ, et al. Eppin: An effective target for male contraception ［J］.Mol Cell Endocrinol, 2006, 250(1-2):157-162.

［7］Kjellberg S, Bjorndahl L, Kvist U. Sperm chromatin stability and zinc binding properties in semen from men in barren unions［J］.Int J Androl,1992,15(2):103-113.

［8］Jonsson M, Linse S, Frohm B, et al. Semenogelins I and II bind zinc and regulate the activity of prostate-specific antigen ［J］. Biochem J, 2005, 387(Pt 2):447-453.

［9］Yoshida K, Yamasaki T, Yoshiik M, et al. Quantification of seminal plasma motility inhibitor/semenogelin in human seminal plasma ［J］. J Androl, 2003 ,24(6):878-884.

［10］Lundwall A, Bjartell A, olsson AY, et al. Semenogelin I and II, the predominant human seminal plasma proteins, are also expressed in non-genital tissues ［J］. Mol Hum Reprod, 2002, 8(9):805-810.(编辑 刘 华)

作者单位：南京医科大学第一附属医院泌尿外科，江苏南京 210029