ACHN人肾癌裸鼠移植瘤模型的生物学特性及放射治疗观察

【摘要】  目的 观察ACHN人肾癌裸鼠皮下移植瘤模型的生物学特性及其对放射线的敏感性。方法 分别利用瘤细胞悬液接种法、瘤块包埋法获得ACHN人肾癌裸鼠移植瘤模型，观察移植瘤的生长情况、成瘤率、肝肺转移率及病理形态。ACHN皮下荷瘤鼠14只，随机分为空白对照组和放疗组，6MV X直线加速器对放疗组移植瘤局部单次照射12Gy，观察裸鼠的耐受性及肿瘤生长抑制情况；透射电镜观察瘤细胞超微结构变化。结果 瘤块包埋法成瘤稳定，成瘤率92.5%，肝转移率43%，未见肺转移。裸鼠对12Gy射线局部照射耐受良好，放疗组移植瘤与空白对照组比较生长明显受抑制(P<0.01)；放疗组瘤细胞凋亡现象明显。结论 ACHN人肾癌裸鼠移植瘤模型可作为肾癌放疗实验研究的有效工具。

【关键词】  肾癌；ACHN；裸鼠；放疗

     肾癌发病率仅次于膀胱癌，居泌尿系肿瘤第二位，且有逐年增高趋势。虽然目前肾癌放疗效果还不理想，但多数学者认为除术前、术后的辅助性放疗能提高手术效果外，单纯与姑息性放疗对晚期病例仍不失为一种重要手段[1]，尤其是在姑息止痛、缓解症状方面。但肾癌放疗效果不理想，如何提升放疗对晚期肾癌的治疗效果是泌尿外科医生感兴趣的话题。我们比较不同手段建立起来的ACHN人肾癌裸鼠移植瘤模型的生物学特性，并进行放射线照射实验，旨在确立肾癌放疗增敏研究的理想荷瘤动物模型。

    1  材料与方法

    1.1  实验材料  雌性BALB/cnu/nu裸小鼠，4-6周龄(由中国科学院上海实验动物中心提供)。在第四军医大学实验动物中心，Specific Pathogen Free(SPF)条件下，恒温(24-26℃)饲养。笼具、垫料、饮水及饲料均作高压和紫外线消毒处理，无菌操作。ACHN人肾癌细胞株购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。RPMI 1640购自美国Hyclone公司，新鲜小牛血清购自杭州四季青公司。2300CD型直线加速器(美国Varian公司)由西安交通大学第二附属医院肿瘤放疗中心提供。H600型电子透射显微镜(日本Hitachi公司)由西安交通大学医学院电镜中心提供。

    1.2  ACHN瘤细胞的复苏与培养  冻存细胞系37℃水浴，振荡。加入RPMI 1640培养液，37℃、95%湿度、50mL/L CO2条件下培养。

    1.3  动物模型的建立  采用细胞悬液接种法及瘤块包埋法两种不同的方式建立人ACHN肾癌裸鼠移植瘤模型。①细胞悬液接种法：取对数生长期细胞，2.5g/L胰酶消化，吹打成单个悬浮细胞，台盼蓝染色并作死、活细胞计数，调整活细胞浓度分别以5×106/0.2mL(A组)和1×106/0.2mL(B组)注入裸鼠右大腿背侧皮下；②瘤块包埋法(C组)：细胞悬液接种法获得的裸小鼠皮下移植瘤，切取小块瘤组织包埋于下一批裸鼠皮下(计为1代)。稳定传代3代以后，获取皮下移植瘤，去除坏死组织，选取生长旺盛的瘤组织，剪成约2-3mm3的瘤块，包埋于裸鼠右大腿背侧皮下。比较不同造模方式下的成瘤率、出瘤时间及肿瘤生长速度。

    1.4  荷瘤动物放疗实验

    1.4.1  预实验确定裸鼠对放射线的耐受性  瘤块包埋法获得荷瘤鼠5只，待皮下移植瘤长至平均直径约8mm时，将裸鼠置于圆柱形有机玻璃容器内，荷瘤后肢拉出，分别给予6MV X线4、6、9、12、15Gy移植瘤局部单次照射。照射条件:吸收剂量率：4Gy/min；源皮距(SSD)：100cm；照射野：4cm×4cm；屏蔽防护：自制低熔点铅屏蔽盒, 铅厚度为8cm；组织补偿：加1cm厚蜡块。连续1周，利用游标卡尺测量瘤体的长径(a)及短径(b)，动态观察瘤体生长情况(瘤体积V= ab2/2)[2]，观察照射期间裸鼠耐受性及照射后肿瘤生长情况。

    1.4.2  ACHN人肾癌裸鼠皮下移植瘤模型放疗实验

    瘤块包埋法获得的荷瘤鼠14只，随机分为放疗组与空白对照组各7只。待皮下移植瘤长至约100mm3大小时，放疗组给予6MV X线12Gy移植瘤局部单次照射，照射条件同1.4.1，空白对照组动物则不给予照射。动态观察肿瘤生长情况，绘制肿瘤生长曲线，比较两组移植瘤时间-体积变化差异。放射线照射后第9日统一断颈处死实验动物，称量移植瘤重量，计算抑瘤率。抑瘤率(%)=(1-放疗组瘤重/空白对照组瘤重)×100%[2]。

    1.5  病理检查  放疗后第9日，统一断颈处死实验动物后，取皮下移植瘤及裸鼠肝、肺，用40g/L甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察移植瘤病理形态及肝、肺转移结节，计算转移率；取米粒大小皮下瘤外缘组织，戊二醛固定，制片后透射电镜观察。

    1.6  统计学处理  各变量保留两位有效数字，以均数±标准差表示。采用SPSS 10.0统计学软件，应用t检验和χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

    2  结    果

    2.1  移植瘤成瘤率及生长特征  A、B、C三组实验裸鼠成瘤率分别为87.5%、33.3%、92.5%(表1，图1)。采用χ2检验，B组成瘤率最低，与A、C组比较差异有统计学意义(P<0.05)，A、C组之间差异无统计学意义(P>0.05)。表1  不同造模方式下的裸鼠成瘤率及出瘤时间

    接种方式接种只数成瘤只数成瘤率接种后出瘤天数出瘤时间一致性生长速度A8787.5%3-4较一致快速B12433.3%*13-19欠一致快速C403792.5%7-9较一致快速

    *P<0.05 vs. A; A：5×106/0.2mL瘤细胞悬液接种组；B：1×106/0.2mL瘤细胞悬液接种法组；C：瘤块包埋组

    图1  ACHN人肾癌裸鼠移植瘤模型

    2.2  裸鼠对放射线的耐受性  从4Gy到15Gy各剂量的放射线照射过程及整个观察期间，各裸鼠均耐受良好，无厌食、腹泻、死亡等现象。实验表明该动物模型对局部放射线照射的耐受性较好。

    2.3  人ACHN肾癌裸鼠移植瘤模型对12Gy射线的反应性  放疗组肿瘤生长速度明显慢于空白对照组(图2)。经12Gy射线照射后第9日，放疗组瘤重为(0.36±0.08)g，明显小于空白对照组瘤重(0.99±0.22)g，两者差异有统计学意义(P<0.01)。由公式计算得出12Gy剂量6MV X射线的抑瘤率为63.64%。

    2.4  病理结果

    2.4.1  肉眼观察  移植瘤呈圆或椭圆形，较规则，颜色暗红，表面血供丰富可见增粗的血管。切面见瘤组织呈鱼肉样，质软易碎，淡红色，包膜基本完整(图3)，直径超过1.5cm的皮下瘤往往出现中央缺血坏死，呈豆渣样。空白对照组实验动物肝转移率为43%(3/7)(图4)，肺上未见瘤转移结节；放疗组未见肝肺转移结节。

    图2  放疗组与空白对照组肿瘤生长速度的比较(显示标准差)2.4.2  光镜观察  镜下瘤细胞呈多边形或圆形，核浆比例大，胞浆呈淡伊红色，核呈圆、椭圆或不规则形，核分裂像多见，部分瘤细胞可见核仁(图5)。瘤细胞排列紧密，成片、团状，也可见腺样或乳头状结构；间质血窦丰富，未见纤维细胞，可见一些坏死区域。肝转移结节内瘤细胞形态与移植瘤相似(图6)。

    2.4.3  透射电镜观察结果  空白对照组：瘤细胞形态不规则，细胞核圆形，核内常染色质丰富，核仁明显，细胞质内细胞器丰富，线粒体体积较小，内质网不多，核糖体丰富，未见凋亡细胞及凋亡小体。放疗组：瘤细胞核内染色质有凝集、边集现象，细胞质内线粒体肿胀，可见到凋亡的瘤细胞及被瘤细胞吞噬的凋亡小体，凋亡细胞核染色质高度凝集成团块样(图7)。

    3  讨    论

    我们曾利用兔肾VX2原位移植瘤模型进行肾癌放疗增敏研究[3]。但VX2细胞病理类型为鳞癌，而临床肾肿瘤为鳞癌者罕见，以其作为研究对象，结果缺乏说服力。裸鼠的细胞免疫缺如，适合进行肿瘤细胞的移植成瘤实验。我们选择的ACHN人肾癌细胞株 (ATCC No. CRL 1611)，由 Dr. Chang 和 Dr. Hogan建立，源于一例患有恶性胸腔积液的肾细胞癌转移患者，恶性度高[4] ，在裸鼠皮下异位移植成瘤率高。黄海鹏等[5]报道成瘤率为75%，我们的实验显示采用瘤块包埋法出瘤率高达92.5%。考虑到瘤块包埋法成瘤率较高，成瘤稳定，且较之接种细胞悬液更符合人体内肿瘤的发生、发展与转移的微环境，故可视为一种理想的成瘤方法。我们同时观察到细胞悬液接种法和瘤块包埋法获得的皮下移植瘤生长十分迅速，在出瘤后2周左右移植瘤体积即可达到1000mm3，生长速度明显快于黄海鹏等[5]报道的“荷瘤鼠第31天平均体积达320mm3”，这可能与瘤细胞的活性差异有关。为了解决肿瘤生长迅速，以致于干预时间不够充分的问题，我们建议在裸鼠出现直径约4mm的暗红色结节，基本排除炎性反应时即开始给予干预。

    我们将瘤块包埋于裸鼠大腿背侧皮下，移植瘤形态规则，在肿瘤直径达6-8mm时，移植瘤边缘多数不超过裸鼠大腿根部，此时进行放射线照射，只需将后肢从固定裸鼠的有机玻璃容器中拉出即可。其余部分用铅块遮蔽，避免了重要脏器被放射线直接照射的可能，大大降低了急、慢性放射损伤的发生。我们的研究显示，接受从4Gy到15Gy不同剂量的放射线单次照射后，裸鼠均耐受良好，可进行后续实验研究。此外，运输过程中使用裸鼠专用运输盒以保证清洁无菌、注意保暖，照射前对放射治疗室彻底清洁消毒等也是确保实验顺利进行的必要条件。

    在利用裸鼠进行放疗实验时，考虑到裸鼠耐受力差、饲养环境严格、脱离该环境易发生感染死亡等特点，小剂量分次照射实际操作往往较困难，采用单次大剂量射线照射进行实验方便易行。我们采用12Gy6MV X直线加速器射线对移植瘤进行局部照射，实验动物均耐受良好，与空白对照组比较，肿瘤生长速度减缓，放疗后第9天瘤重明显低于空白对照组，统计学分析差异有显著性。超微结构观察显示放疗组凋亡细胞多见，提示促凋亡可能是放射线抑制肿瘤生长的机制之一。为便于后续的放疗增敏实验研究，选用的射线剂量要为放疗增敏剂留出增效空间。Raju等[6] 选用15Gy137Cs γ射线对人鼻咽癌裸鼠移植瘤进行放疗增敏研究；Liu等 [2]采用单次10Gy放射线进行裸鼠移植瘤局部照射研究p21反义寡核苷酸的放疗增敏作用。我们观察到12Gy 6MV X射线抑瘤作用明显，但未使肿瘤出现生长停滞、消退等现象，可用于后续的放疗增敏的实验研究。

    不可否认，人肾癌裸鼠皮下移植瘤由于不在原位，其侵袭、转移等生长特性与原位移植瘤都存在差异；此外，人肾癌细胞接种到裸鼠体内后其生长特性也发生了改变，因此，还有待开发更为接近人类疾病状态的荷瘤动物模型来进行放疗和放疗增敏的实验研究。

【参考文献】
  [1]Wersll PJ, Blomgren H, Lax I, et al. Extracranial stereotactic radiotherapy for primary and metastatic renal cell carcinoma [J]. Radiother Oncol, 2005, 77(1): 8895.

[2]Liu XF, Xia YF, Li MZ, et al. The effect of p21 antisense oligodeoxynucleotides on the radiosensitivity of nasopharyngeal carcinoma cells with normal p53 function [J]. Cell Biol Int, 2006, 30(3):283287.

[3]王子明, 佘军军, 程伟，等. 兔肾VX2移植瘤模型的建立及其超声显像检测 [J]. 西安交通大学学报(医学版), 2006, 27(1):5558.

[4]Chang AY, Keng PC. Potentiation of radiation cytotoxicity by recombinant interferons, a phenomenon associated with increased blockage at the G2M phase of the cell cycle [J]. Cancer Res, 1987, 47(16):43384341.

[5]黄海鹏，曾进，李晓东，等. 人ACHN肾癌裸鼠移植瘤模型的建立及特性研究 [J]. 现代肿瘤医学, 2005, 13(1):3233.

[6]Raju U, Ariga H, Koto M, et al. Improvement of esophageal adenocarcinoma cell and xenograft responses to radiation by targeting cyclindependent kinases [J]. Radiothe Oncol, 2006, 80(2):185191.

作者单位：西安交通大学医学院第二附属医院：1. 泌尿外科；2. 肿瘤放疗中心，陕西西安 710004