点击显示 收起
【关键词】 膀胱移行细胞癌 因治疗 子成像
绝大多数膀胱移行细胞癌(TCC)属表浅型，经尿道切除后复发率高。目前，TCC已位居美国泌尿生殖系统恶性肿瘤发病的第二位，并占到尿路肿瘤病死率的第二位。在过去的20年间，膀胱癌的发病率有所升高。70%-80%的TCC患者表现为低度恶性、非浸润性或局限于黏膜内的浅表型乳头状瘤，经尿道切除后膀胱内灌注化疗或免疫治疗能延长肿瘤非进展期。但60%的患者肿瘤仍会复发，复发瘤中多达20%可能表现为高度恶性和浸润性。平均15%-30%的TCC患者，被诊断为浸润型癌，其中给予局部治疗的患者，约半数会在2年内复发并转移，其中骨骼、肝脏与肺脏是膀胱癌转移最常见的三个部位。与其他类型的肿瘤类似，TCC患者的死亡率也取决于其转移灶状况。即使采取目前最佳的治疗方案，其生存中位数也仅为13-15个月[14]。然而，若能早期发现其转移灶，则可提供更多的治疗方案，长期生存率将会提高。在本文中我们探讨将无创的分子成像技术引入治疗方案的可能性，以求TCC得到更好的治疗效果。
1 腺病毒介导的TCC基因治疗
基因治疗是恶性肿瘤和良性疾病治疗的一种新手段，它以改变疾病发病相关的某些基因为特点。鉴于实际及理论的多方面考虑[56]，重组腺病毒已成为引起人们广泛关注的肿瘤基因治疗的载体。目前它已成为研究以腺病毒为基础的TCC基因治疗的主要载体[7]。但病毒的有效性及其可能的副作用已经引起争议。例如，目前已证实重组腺病毒在支气管上皮中的基因治疗效能较低，因为腺病毒对分化成熟的支气管纤毛上皮的黏合能力较未分化成熟的上皮差[8]。同时，由于病毒蛋白具有细胞毒性和免疫原性，反复给予腺病毒干预，可能会导致宿主对其产生免疫反应。使用佐剂可以增加低剂量病毒的感染率，这样就可避免使用高剂量病毒引起的副作用。
腺病毒进入靶细胞是导入基因的一个限速步骤。腺病毒与靶细胞表面的初始结合是一个受体介导的过程[910]，即通过病毒二十面体衣壳的12个顶角辐射出的延伸蛋白与靶细胞细胞膜上的特异性受体相结合[11]。随后，以Ⅴ型腺病毒为例，αvβ5及αvβ3等整合素被动员，并与病毒受体复合物相结合，以增强靶细胞对病毒的内化作用[12]。病毒与靶细胞受体结合是成功进行基因转染的关键步骤，因此靶细胞受体的识别对腺病毒介导的基因治疗至关重要。
Ⅴ型腺病毒常用来作为基因治疗的病毒载体，其受体目前已被成功克隆。序列分析表明，这种腺病毒受体，即柯萨奇腺病毒受体(CAR)[1314]，其cDNA编码一种典型的免疫球蛋白样膜蛋白，具有两个免疫球蛋白结构域，可与腺病毒衣壳蛋白相互作用(图1)。除编码细胞外结构域外，CAR的cDNA还编码一个含22个氨基酸的跨膜蛋白，以及一个含107个氨基酸的、具有确定的酪氨酸磷酸化位点的细胞内蛋白。基于其蛋白的结构特点，CAR不仅可作为腺病毒受体，还可能具有其他生理功能，例如，可作为细胞黏附分子。
2 CAR作为腺病毒受体及抑癌基因在TCC中的作用
在研究CAR的生理作用及其细胞定位时，我们发现当细胞[ 如中国仓鼠卵巢细胞和小猎犬肾上皮细胞(MDCK细胞)]获得极性时，CAR将定位于细胞紧密连接处。在极化的细胞中，CAR和ZO1(细胞紧密连接复合物中的一种蛋白)能够从细胞裂解产物中共沉淀。溶解状态的CAR，能够抑制细胞紧密连接的形成[15]。所以，CAR是细胞间紧密连接的组成成分之一，可能在细胞极性的形成过程中发挥一定作用。
图1 CAR蛋白的结构及其生物学活性的关系（略）
Ig：免疫球蛋白；Tm：跨膜区
最近我们还证实，细胞CAR的表达水平与其对病毒的敏感性显著相关[1617]。此外，我们观察到，在多种TCC细胞株与组织标本中，CAR的表达存在差异[16,1819]。增强CAR低表达细胞的表达水平，可明显提高其对腺病毒的感染率。同时可见TCC病灶中CAR表达下调，但邻近的正常组织中无此改变，这表明CAR可能在TCC的进展中发挥一定病理生理作用。我们的研究结果表明，增加CAR的基因表达能抑制肿瘤细胞在体外和体内的生长[16,18]。相反，降低某些TCC细胞株CAR的表达水平(使用反义载体)能提高其体内外的生长速率[18]。上述结果表明，CAR是TCC细胞中一肿瘤抑制因子。综上所述：①CAR是一种典型的细胞黏附分子；②CAR可促使TCC的细胞周期停滞，并使p21和低磷酸化Rb聚集；③CAR的黏附活性与其生长抑制功能相一致；④CAR的细胞内结构域在诱导TCC细胞的生长抑制信号方面起关键作用。基于上述研究结果，我们认为CAR可以通过重建细胞间的相互作用来抑制肿瘤的生长。同时，CAR也作为膜受体发挥其功能，通过传递信号进入胞核来抑制细胞增殖。
3 利用外遗传修饰因子及天然化合物上调CAR基因表达
显然，许多肿瘤CAR的表达减少，限制了腺病毒介导的基因治疗[1622]。为了克服这一障碍，可通过修饰病毒衣壳蛋白来改变病毒对靶细胞的亲嗜性[2324]，或经基因转染增强靶细胞内源性CAR的表达。另外，提高靶细胞中内源性CAR的表达还可增强其对病毒的敏感性。包括我们实验室在内的若干研究均表明，体外实验中，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDACI)可能会激活细胞中CAR基因的表达，这表明CAR基因表达下调可能是由于外遗传调控的改变引起的，而并非基因突变所致[2528]。
“外遗传”是指基因表达中可遗传的变化由非核苷酸序列改变的机制所致[4]，DNA甲基化和组蛋白修饰是两个主要的可能机制。除基因突变外，许多研究揭示抑癌基因改变的表遗传调节，是肿瘤发病的一个重要机制。TCC中，应用HDACI可增加CAR的表达，并可增强TCC细胞对腺病毒的敏感性[27]。有关HDACIs的临床试验正在进行中，联合应用HDACIs和重组腺病毒将为TCC患者提供更为有效的治疗方案。
我们筛选了多种化学物质，以寻找可增强HDACI对肿瘤的杀伤效应，并提高对CAR诱导作用的新的化学药品。最近我们发现了两种可增强HDACI活性的化学物质[29]：植物异黄酮和肉桂氨茴酸[化学式：N(3′,4′二甲氧基肉桂酸)邻氨基苯甲酸]。研究还表明，在其他异黄酮如依普黄酮、鸡豆黄素A中，金雀异黄素是可增强CAR的诱导作用并提高HDACI疗效的最有效的化合物。此外，基于对肉桂氨茴酸的结构分析，我们发现了两种同系物，即DMCA(化学式：2，3二甲氧基肉桂酸叠氮化物)和燕麦蒽酰胺B[化学式：N(4羟基3′甲氧基(E)肉桂酰基)5羟基邻氨基苯甲酸]，它们均可增强HDACI诱导CAR基因的表达，其效应比肉桂氨茴酸更高，并且可促进TCC细胞凋亡。有趣的是，我们发现的这些化合物均来源于自然界的植物，如金雀异黄素来源于黄豆，燕麦蒽酰胺B来源于燕麦[30]，这些化合物可作为TCC患者辅助性治疗的潜在药物。
4 非侵入性分子成像技术在TCC研究中的应用前景
广义的“分子成像”技术可定义为在细胞和分子水平上对活体内生物学进程进行描述和检测的一种手段。分子成像是一个新的研究领域，它不是在解剖学水平，而是在细胞学或基因水平对疾病进行成像诊断。正是由于对疾病遗传机制知识的掌握，以及对遗传因子检测新技术的发展，才导致了基因表达成像的出现。为使体内特定的分子成像，必须遵循几个关键的标准：①具备合理药效动力学的高亲和探针；②这些探针具有穿透机体运输屏障的能力(如血管、组织间质、细胞膜)；③可采用化学或生物学扩增方法；④应用敏感、迅速、高分辨率的显像技术。目前有多种影像学技术可供利用[3134]，如计算机X线断层成像(CT)、磁共振成像(MRI)、核医学成像、光成像和超声成像。磁共振波谱分析(MRS)是检测生理及分子水平变化的唯一工具，而CT和MRI只提供解剖学上的信息。尽管这样，与特定疗法和(或)特定研究肿瘤有关的分子探针仍需要进一步发展和完善。除了应用核素和磁共振探针成像外，结合光成像技术，生物发光(BLI)、化学发光或荧光报告分子可被用于追踪体内分子及细胞水平的生物活动(实时描述体内基因表达及相应的蛋白功能活性)。光成像技术可以通过检测报告基因的复制来纵向追踪疾病的进程，观测机体对治疗疗效的反应，以及组织和器官中干细胞的分化结局和命运。与其他技术相比，核医学成像和光成像都表现出较高的灵敏度[35](表1)。
表1 分子成像模式的相关属性（略）
核成像技术—正电子发射成像(PET)、单光子发射计算机辅助成像(SPECT)以及γ闪烁显像由于其灵敏度较高(在纳摩尔和皮摩尔范围内)，故特别适用于此研究。据估计，每个细胞最小大约有10000个靶分子即能被PET检测。PET显像原理是当组织内的一个正电子和一个电子发生湮灭后同时产生两个光子，它们的入射角互成180°，被探测器所接收进而成像。SPECT则是通过向组织引入外来可发射γ射线的试剂，探测组织发出的γ光子来成像。与SPECT相比，PET的优点为灵敏度较高、可以使用生理示踪剂。64Cu和124I已分别用于缺氧和基因表达的PET成像[3637]。
另一方面，生物发光显像(BLI)已在临床前期肿瘤研究中尝试使用。裸鼠的膀胱内原位灌注表达荧光素酶的TCC细胞(注入膀胱壁内)，该模型模仿了TCC患者中最常见的浅表性肿瘤的发病，随后裸鼠皮下注入荧光素(荧光素酶的底物)，然后应用强化的电荷耦合设备(ICCD)进行显像，该设备可检测荧光素和荧光素酶相互作用产生并透过皮肤散射出的光子。膀胱灌注后4至5周，在未能触及任何肿瘤包块前，BLI已可检测到膀胱内的1个肿瘤灶(图2A)。7至8周后，能在局部淋巴结或远端内脏器官，如肺脏，可检测到明显的发光区。其后，收集可能有潜在TCC转移的小鼠器官作病理检查，并将这些组织的一小部分在体外进行原代细胞培养，用G418筛选克隆。获得这些细胞的克隆后，将其重新灌注到膀胱，这些癌细胞表现出了高度的成瘤性(灌注后2周在膀胱内探测到BLI信号)和转移性活性(灌注后4周在腹腔内其他部位探测到BLI信号)(图2B)。此外，我们还利用该模型评估了FK228(一种组蛋白脱乙酰基酶抑制剂)的疗效，在BLI信号下可清晰地观察肿瘤的退行性变化(图2C)。显然，BLI是一种重要的非侵入性检测手段，它可以探测肿瘤细胞的时空分布，并大大减少了所需实验动物的数量以及探查肿瘤转移所需的外科操作。
5 应用细胞穿膜肽(CPP)作为成像探针检测转移性TCC
近来，从化学的观点去理解生物学机制，即化学生物学，已经引起了广泛的关注。这种研究细胞内化学物质运输的方法，也适用于化学生物学的研究。例如，可以用这种方法将带有荧光或交联剂的肽或蛋白导入细胞。在磷脂酶Cδ的普列克底物蛋白同源结构域的基础上，Sugimoto建立了一种新的1，4，5 三磷酸肌醇(IP3)荧光生物传感器[38]，即将一种对周围环境敏感的荧光基团6溴乙酰基2二甲基萘胺连接到位于IP3结合袋边缘的半胱氨酸上。尽管大多数肽和蛋白不能穿过细胞膜，这限制了它们与胞内靶分子的结合，但有学者偶然发现，当将HIV 转录的反式作用因子(Tat)加入细胞培养基中时，Tat可被内化入细胞[3940]。这些都是CPP运输系统的新发现。
使用CPP作为运输载体将功能分子导入细胞，能够提高生物靶分子的特异性，最近使用免疫抑制剂阻止移植排斥的研究阐明了该方案的机理[41]。当前免疫抑制剂主要是抑制依赖钙调蛋白的磷酸酶，其底物包括T细胞内的NFAT(活化T细胞核因子)来发挥免疫抑制作用。有关蛋白结合方面的研究表明，来源于NFAT钙调蛋白结合位点的多肽，能选择性地干扰NFAT与钙调蛋白的结合，且并不改变磷酸酶活性，这是维持正常肾功能所必需的。将与CPP融合的多肽导入小鼠体内，发现其具有免疫抑制功能，与传统的免疫抑制药物常引起肾功能衰退相比，也并未发现其具有太多副作用。由于基因治疗存在与运载系统相关的潜在疾病风险，相比之下，具有高效运输性能的CPP将作为可选择的一种新的治疗方案。显然，CPP作为一种能被细胞迅速摄取的特异性小分子，可能成为显像剂的一种理想选择。
图2 使用人TCC细胞为实验性治疗(C)建立的原位模型(A)和转移模型(B)（略）
使用Angiocath静脉留置针将T24细胞灌注入膀胱。灌注后2周，开始进行BLI显像，每周一次
最近，我们发现了一个独特的CPP多聚精氨酸分子，对前列腺和膀胱有明显的组织特异性，能被其有效的吸收。虽然用来运载不同分子进入细胞的各种各样的CPP序列已被测定，但并无其器官或组织特异性的研究报道。尽管大多数新发TCC 病例为低度恶性或非侵袭性，但我们正研究应用CPP作为一种新的PET成像探针，在患者出现症状之前，早期检测侵袭性或转移性TCC的出现。然而，还存在一种高分级肿瘤，其特征为进展迅速、局部浸润、累及邻近器官并有局部和远端转移，如有淋巴结转移则可增加复发和远处转移的概率，这组患者的5年存活率只有20%-25%。肿瘤局部蔓延情况的术前诊断有助于选择适当的膀胱保留手术、神经或阴道保留手术以及盆腔清扫术。以前，利用影像学检查进行TCC分期是受到限制的，CT扫描仅能显示浸润范围超出膀胱壁的体积较大的肿瘤，其准确率为64%-92%，CT检测淋巴结转移的准确率为70%-90%，假阴性率高达40%。同样，利用MRI进行分期也不能令人满意，其准确率为60%-75%。这些影像方法的主要缺陷在于依赖结节大小和解剖学变化来诊断肿瘤。由于18F氟脱氧葡萄糖PET(FDGPET)可以检测不同的代谢活动，那么PET对膀胱癌的淋巴结分期可能优于CT 或MRI ，据报道其灵敏度为67%，特异度为86%，准确率为80%[4243]。另一方面，研究者尝试使用不被尿液排泄的示踪剂以提高PET检测的灵敏度。Ahlstrom 与coworkers发现，11C甲硫氨酸优于FDG，但应用甲硫氨酸PET检测肿瘤的灵敏度也仅为78%(18/23)[44]，因此，需要进一步研究具有更高敏感性和特异性的示踪剂，这样可应用PET早期检测转移性TCC，并进行分期。
总之，由于TCC细胞的异质性，任何有效的疗法都应选择具有不同分子作用机制以及具备潜在增效功能的药物。在治疗期间，应利用各种分子或细胞成像技术，实时监测癌细胞对药物治疗的反应。
【参考文献】
[1]Sternberg CN, de Mulder PH, Schornagel JH, et al. Randomized phase III trial of highdoseintensity methotrexate, vinblastine, doxorubicin, and cisplatin (MVAC) chemotherapy and recombinant human granulocyte colonystimulating factor versus classic MVAC in advanced urothelial tract tumors: European Organization for Research and Treatment of Cancer Protocol no. 30924 [J]. J Clin Oncol, 2001, 19:26382646.
[2]Sternberg CN, Yagoda A, Scher HI, et al. Methotrexate, vinblastine, doxorubicin, and cisplatin for advanced transitional cell carcinoma of the urothelium. Efficacy and patterns of response and relapse [J]. Cancer, 1989, 64:24482458.
[3]Roth BJ, Bajorin DF. Advanced bladder cancer: the need to identify new agents in the postMVAC (methotrexate, vinblastine, doxorubicin and cisplatin) world [J]. J Urol, 1995, 153:894900.
[4]von der Maase H, Hansen SW, Roberts JT, et al. Gemcitabine and cisplatin versus methotrexate, vinblastine, doxorubicin, and cisplatin in advanced or metastatic bladder cancer: results of a large, randomized, multinational, multicenter, phase Ⅲ study [J]. J Clin Oncol, 2000, 18:30683077.
[5]Graham F, Prevec L. Manipulation of adenovirus vector [M]//Murray EJ. eds. Methods in Molecular Biology: Gene Transfer and Expression Protocol. New Jersey: Humana Press, 1991, 7:109128.
[6]Grunhaus A, Horwitz MS. Adenovirus as cloning vector [J]. Semin Virol, 1992, 3:237252.
[7]Harrison GS, Glode LM. Current challenges of gene therapy for prostate cancer [J]. Oncology, 1997, 11:845856.
[8]Zabner J, Freimuth P, Puga A, et al. Lack of high affinity fiber receptor activity explains the resistance of ciliated airway epithelia to adenovirus infection [J]. J Clin Invest, 1997, 100:11441149.
[9]Stevenson SC, Rollence M, White B, et al . Human adenovirus serotypes 3 and 5 bind to two different cellular receptors via the fiber head domain [J]. J Virol, 1995, 69:28502857.
[10]Freimuth P. A human cell line selected for resistance to adenovirus infection has reduced levels of the virus receptor [J]. J Virol, 1996, 70:40814085.
[11]Philipson L, LonbergHolm K, Pettersson U. Virusreceptor interaction in an adenovirus system [J]. J Virol, 1968, 2:10641075.
[12]Hashimoto Y, Kohri K, Akita H, et al. Efficient transfer of genes into senescent cells by adenovirus vectors via highly expressed αvβ5 integrin [J]. Biochem Biophy Res Commun, 1997, 240:8892.
[13]Bergelson JM, Cunningham JA, Droguett G, et al. Isolation of a common receptor for Coxsackie B viruses and Adenoviruses 2 and 5 [J]. Science, 1997, 275:13201323.
[14]Tomko RP, Xu R, Philipson L. HCAR and MCAR: the human and mouse cellular receptors for subgroup C adenoviruses and group B coxsackieviruses [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94:33523356.
作者单位：美国德州大学西南医学中心泌尿外科，德州达拉斯，美国 75390