人膀胱浅表性移行细胞癌基因表达变化的基因芯片研究

【摘要】  目的 研究人膀胱浅表性移行上皮细胞癌(TCC)和正常膀胱组织差异表达基因。方法 应用基因芯片技术对6例膀胱浅表性TCC癌组织和正常膀胱组织的总RNA进行检测。结果 在13939条目的基因中共发现差异表达基因720条。在癌组织中234条表达增加，486条表达降低；678条能在Gene Bank中登录。结论 膀胱浅表性TCC的发生、发展是多基因异常引起多条传导通路异常致使细胞恶性转化的结果，基因芯片技术可同时定量研究大量基因表达水平，是一种稳定、高效的方法。

【关键词】  膀胱肿瘤 移行细胞癌 基因芯片

　　膀胱肿瘤是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，具有复杂的生物学行为，临床上有不同的表现形式和预后。其中75%为浅表性移行细胞癌，复发率为40%-60%，复发者中约有20%可发展为浸润性癌。膀胱癌患者预后差, 早期诊断和治疗尤为重要。我们利用高通量、高灵敏度的基因芯片技术，对膀胱浅表性移行细胞癌(transitional cell carcinoma, TCC)及正常膀胱组织的基因表达进行了筛选和分析，以利于更进一步的膀胱癌分子生物学研究。

　　1  材料与方法

　　1.1  取材  6例膀胱浅表性TCC组织取自西安交通大学第一医院泌尿外科2003年7月-2004年6月手术切除标本，均经病理证实。患者年龄48-72岁，平均58岁。病理分级：G1 5例、G2 1例。TNM分期：T1 6例。正常膀胱组织取自6例良性前列腺增生患者的正常膀胱黏膜。取材后立即用液氮保存。

　　1.2  RNA抽提及鉴定  采用改良酚氯仿一步法抽提总RNA。以分光光度计检测其吸光度值(A)，并行热稳定试验，于-80℃和70℃保温1h后分别电泳检测28S、18S条带变化。

　　1.3  预杂交和探针制备  将配制好的预杂交液放入95℃水浴锅内变性2min，将待预杂交的玻片放入95℃水浴锅内变性30s，玻片取出后即放入无水乙醇中30s，晾干。将已变性的预杂交液加到玻片的点样区域内，盖上盖玻片，放入杂交箱内42℃预杂交5-6h。参照Schena等[1]方法逆转录标记cDNA。Cy32dUTP标记正常膀胱组织mRNA，Cy52dUTP标记浅表性TCC组织mRNA。

　　1.4  表达谱芯片的制备  芯片型号为BiostarH140s，由上海博星基因芯片有限责任公司提供。芯片包含14112个靶基因的cDNA克隆，其中待检测基因数13939条，阳性对照为人管家基因，共96条，阴性对照为水稻基因，共16条，内参是不同浓度的人管家基因，共20条，空白对照共41条。以通用引物进行PCR扩增。

　　1.5  杂交及洗涤  将基因芯片和杂交探针分别于95℃水浴锅内变性后置于杂交舱内，加入混合探针，用杂交密封舱加以密闭，不留有气泡。于60℃恒温杂交箱内杂交18h。依次用2×标准枸橼酸盐水(SSC)溶液+2g/L十二烷基硫酸钠(SDS)溶液、1g/L SSC溶液+2g/L SDS溶液及1g/L SSC溶液分别洗涤10min，室温晾干。

　　1.6  差异基因检测与生物学信息分析  用General Scanning公司的ScanArray4000扫描芯片。ImaGene3.0软件分析Cy3、Cy5荧光信号强度，计算Cy5/Cy3值。阳性结果判断：①Cy5/Cy3>3.0或<0.3；②该基因点的Cy3、Cy5信号值皆大于200，或者其中之一大于800；③该基因点的Cy5信号值/Cy3信号值的比值为0.1-10。

　　2  结果

　　2.1  总RNA的提取和总RNA完整性的鉴定  抽取的总RNA A260/A280>1.9，热稳定试验70℃保温1h与保温前-80℃电泳条带比较，显示28S条带无明显降解，说明提取总RNA的完整性较好，没有降解(图1)。

　　图1  总RNA质量控制电泳图（略）

　　T, T′：浅表性膀胱癌组织总RNA；N, N′：正常膀胱组织总RNA；T, N：保温前-80℃的总RNA；T′, N′：70℃保温后的总RNA

　　2.2  基因芯片杂交结果可靠性的控制  ①严格取材，每例膀胱癌在同一部位取新鲜无坏死的癌组织(癌细胞占细胞总数75%)两部分，一部分作基因芯片，另一部分作病理切片。正常膀胱组织取自良性前列腺增生患者的膀胱黏膜，标本迅速置于液氮中，同时抽提实验样本的RNA，且质量一致。②6例膀胱癌组织各取等量总RNA组成RNA混合池；同时取6例正常膀胱组织等量总RNA组成RNA混合池。

　　2.3  基因芯片杂交结果  浅表性TCC组织表达谱(Cy5)扫描结果与正常组织表达谱(Cy3)扫描结果，经计算机数据叠加，产生的图像见图2。该图是每个基因在两个组织中表达丰度的比值，反映了癌组织与正常组织基因表达的差异。杂交信号强度散点图分布见图3。依本研究的判断标准，发现浅表性TCC组织与正常膀胱组织有差异表达基因720条，为检测基因总数的5.2%(720/13939)。在浅表性TCC组织中上调基因234条，下调基因486条，其中有42条新基因尚未在Gene Bank登录，占检测基因总数的0.29%。部分表达显著下调的已知基因见表1，部分表达显著上调的已知基因见表2。

　　图2  芯片杂交结果扫描图（略）

　　如cy3信号较强，则该点多显绿色(下调趋势)；如cy5信号较强，则该点多显红色(上调趋势)；如强度相似，则呈现黄色

　　图3  芯片杂交结果扫描散点图（略）

　　每一数据点代表芯片上一个基因点的杂交信号，红色为3>Ratio>0.33；黄色为0.33>Ratio>3

　　表1  浅表性TCC部分差异表达显著下降的基因（略）

　　表2  浅表性TCC部分差异表达显著上调的基因（略）

　　3  讨论
   
　　肿瘤的发生和发展是一个复杂的多阶段的过程，是许多肿瘤相关基因和信号传导分子表达失常所致。基因芯片具有高通量、特异性好、快速的特点，可直接检测mRNA的种类及丰度，进行整个基因组范围的基因表达分析，并可以发现许多新的、潜在的重要肿瘤相关基因，是研究基因表达的有力工具。
   
　　SanchezCarbayo等[2]利用基因芯片技术研究了9个膀胱癌细胞系和原发膀胱癌的基因表达谱，发现了与膀胱癌进展有关的许多靶蛋白，并进一步研究了其与膀胱癌的关系。Dyrskjot等[3]利用寡核苷酸芯片和分层聚类分析的方法，建立了32个基因的分类模型用于膀胱癌分型。可见基因芯片技术也是膀胱肿瘤研究的一个有效手段。
   
　　本实验利用人类全基因表达谱芯片，研究膀胱浅表性TCC和正常膀胱组织的基因表达变化，结果显示，膀胱癌基因表达谱与正常膀胱组织相比存在很大差别，表达增加的基因数目远少于表达降低的基因数目。分析芯片杂交结果扫描散点图发现，偏离斜线的点多位于下方，意味着基因的表达下调多于上调。这可能与癌细胞的功能简单化有关。
   
　　本实验检测到一系列生长因子信号传导通路相关基因在TCC组织与正常组织中的表达差异显著，如PTK相关基因(PTK2，PTK9 )、细胞传递蛋白(ILF3)、蛋白激酶(TTK)等表达上升, 而与PTK 作用相反的细胞信号和传递蛋白(TU3A、CYR61) 表达降低，表明TCC的发生、发展可能与生长因子信号传导通路异常活跃有关。已明确酪氨酸激酶(PTK)受体通路和G蛋白连接受体通路是细胞信号传导网络中最重要通路。大量文献报道包括TCC在内的多种恶性肿瘤都有PTK的过量表达，表达随细胞分化程度降低而增强，表达越强,预后越差，更易复发、转移。芯片检测结果表明在多条信号传导通路的多个环节上，TCC组织均较正常组织活跃，提示正常移行上皮的恶变涉及不同信号传导通路的多个环节。
   
　　资料显示细胞凋亡异常在TCC发生、发展中占有重要地位。本实验检测到凋亡相关基因(AF3 11912、SPARCL1、1329)、Frizzle及其相关蛋白(FZD7)表达降低，这些凋亡相关基因在肿瘤中表现为同步下调,结果使肿瘤细胞凋亡程度减少。而凋亡抑制基因表达有增高(CASP3)，也有降低(CASP4、EMP1)，表明浅表性TCC的发生、发展与细胞增殖和凋亡的动态平衡破坏相关。浅表性TCC中可能存在细胞增殖失控、凋亡受阻情况，也可能出现凋亡增加的情况，只是细胞凋亡增加的速率低于恶性增殖速率。因此浅表性TCC中凋亡减少，并不排除凋亡抑制减弱。
   
　　下调表达的基因多数是抑癌基因，在下调表达的基因中，细胞周期依赖激酶抑制因子(p27/Kip1)是细胞周期的负调控因子，通过对cyclinECDK2等复合物的抑制，使细胞周期不能通过G1S点，从而抑制细胞增殖，使DNA受损的细胞有机会修复或进入编程性细胞死亡，被认为是抑癌基因。虽然目前的研究表明p27kip1很少发生其编码基因的突变，但却发现其蛋白水平及活性改变与许多人类肿瘤密切相关。本实验发现，p27/Kip1在浅表性膀胱癌中下调表达(0.163)，提示与膀胱癌发生有关，可能是一个肿瘤发生的早期信号。Dybowski等[4]研究膀胱癌发现，p27/Kip1的主要作用是抑制细胞增殖，该基因的过度表达可以使细胞增殖停留于G1期，从而发挥抑制肿瘤的作用。
   
　　乳腺癌转移抑制因子(BRMS1)，是新近发现的一种肿瘤转移抑制基因。该基因不影响肿瘤形成，仅仅抑制肿瘤细胞向远隔部位的转移。实验表明[5]将BRMS1cDNA转染人黑色素瘤细胞株MelJjuSo和C8161.9并不改变两者的肿瘤形成能力，但是可以显著地抑制肿瘤转移的发生。同时，黑色素瘤中可持续检测到BRMS1表达时，但其在肺上的转移灶中却检测不到。表明BRMS1可能是肿瘤转移抑制基因。BRMS1基因对膀胱癌细胞株T24及源于其并具有转移能力的T24T的研究结果也观察到T24中BRMS1mRNA表达较T24T高，但还没有关于BRMS1对膀胱癌细胞转移抑制的进一步研究[6]。本实验发现BRMS1在浅表性TCC中表达明显下调(0.152)，提示该基因可能与浅表性膀胱癌的发生、转移有关。
   
　　上调表达的基因多数是癌基因，组织蛋白酶E属于半胱氨酸、丝氨酸蛋白水解酶类(4.700)，该酶类在肿瘤的浸润和转移中有重要作用。组织蛋白酶B、D、E不仅在膀胱癌、肾癌、胃癌、结肠直肠癌及其转移灶中高表达，在发育异常的膀胱癌旁组织中也存在高表达，而且在膀胱癌患者的血清中浓度增高，说明组织蛋白酶B、D、E与膀胱癌癌的发生、发展及预后密切相关，并且可以作为膀胱癌早期诊断的肿瘤标记物[7]。
   
　　实验发现抑癌基因在肿瘤中有下调(DCL1)和上调(NDRG1)表达的情况，纤维素样生长因子也存在类似情况(FGFR1下调，FGFR3上调)，说明肿瘤发生、发展的内在动态平衡被破坏；基质金属蛋白酶(MMP)以及MMPS抑制剂的上调和下调表达在肿瘤的转移和浸润方面发挥着重要作用；DMBT1与肿瘤的局部转移和淋巴的远处转移、预后有关；p33ING1的下调表达与肿瘤的分期和膀胱癌患者的总体生存率明显相关；本实验结果提示的差异基因在其他肿瘤中也有类似改变,说明不同肿瘤的相似表型有共同的基因变化基础。
   
　　除了上述已知基因外，实验检测到42条与TCC相关的新基因，尚未在GeneBank登录，说明本方法在寻找新的肿瘤相关基因方面有积极的意义。
   
　　总之，肿瘤的发生、发展是多基因异常引起多条传导通路异常，致使细胞恶性转化的结果。通过对浅表性膀胱癌基因表达变化的基因芯片研究，可以发现膀胱肿瘤中最普遍、最相关的一些肿瘤标记物，通过对这些肿瘤标记物的聚类分析，可用来区别不同病理类型或不同临床预后的膀胱癌患者，有可能发展成为血清或尿液检测的肿瘤标记物在临床上广泛应用；它本身也可能成为一个潜在的基因治疗靶点[89]。可见利用基因芯片技术筛选与膀胱癌有关的基因，是一个有用的工具。

【参考文献】
  　[1]Schena M, Shalon D, Davis RW, et al. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray [J]. Science, 1995, 270:567570.

　　[2]SanchezCarbayo M, Socci ND, Charytonowicz E, et al. Molecular profiling of bladder cancer using cDNA microarrays:defining histogenesis and biological phenotypes [J]. Cancer Res, 2002, 62(23):69736980.

　　[3]Dyrskjot L, Thykjaer T, Kruhoffer M, et al. Identifying distinct classes of bladder carcinoma using microarray [J]. Nat Genet, 2003, 33(1):9096.

　　[4]Dybowski B, Kupryjanczyk J, Rembiszewska A, et al. P27(Kip1)and Ki67 expression analysis in transitional cell carcinoma of the bladder[J].Urol Res, 2003, 31(6):397401.

　　[5]Lombardi G, Di Cristofano C, Capodanno A, et al. High level of messenger RNA for BRMS1 in primary breast carcinomas is associated with poor prognosis [J]. Int J Cancer, 2007, 120(6):11691178.

　　[6]Seraj MJ, Harding MA, Gildea JJ, et al. The relationship of BRMS1 and RhoGDI2 gene expression to metastatic potential in lineage related human bladder cancer cell lines [J]. Clin Exp Metastasis, 2000, 18(6):519.

　　[7]Gontero P, Banisadr S, Frea B, et al. Metastasis markers in bladder cancer: a review of the literature and clinical considerations [J]. Eur Urol, 2004, 46(3):296311.

　　[8]SanchezCarbayo M. Recent advances in bladder cancer diagnostics [J]. Clin Biochem, 2004, 37(7):562571.

　　[9]SanchezCarbayo M. Use of highthroughput DNA microarrays to identify biomarkers for bladder cancer [J]. Clin Chem, 2003, 49(1):2331.

　　(编辑 邱 芬)

作者单位：西安交通大学泌尿外科研究所，陕西西安 710061