泌尿外科组织工程技术的研究现状和展望

【关键词】  泌尿外科

　  泌尿外科组织工程技术为泌尿道的组织、器官的微创修复和功能重建带来了新的希望。近年来,有关泌尿系组织工程的种子细胞和支架材料的研究以及组织工程化组织如肾脏、输尿管、膀胱、尿道、阴茎海绵体等的实验和临床研究报道层出不穷。其基本方法是应用细胞生物学和工程学的原理，将体外培养扩增后具有生物学活力及特定功能的细胞(种子细胞)与可降解生物支架材料复合，然后将该细胞支架复合物( 组织工程化组织)植入体内组织缺损部位，细胞在支架降解吸收的过程中分泌新的细胞外基质，形成具有正常形态和功能的组织，用以修复或改善损伤组织或器官的结构与功能,达到真正意义上的生物学重建[1]。最近，Atala报道采用组织工程化膀胱成功修复7例脊髓膜膨出患者的神经原性膀胱的临床研究更为泌尿外科组织工程技术从基础研究向临床应用迎来了曙光[2]。本文就泌尿外科组织工程技术中种子细胞、支架材料、组织构建以及临床应用等方面作一介绍。

    1  种子细胞的研究

    尿路组织工程的种子细胞主要有尿路上皮细胞和平滑肌细胞，源于这两类细胞能在体外培养扩增。理论上1cm×1cm的尿路上皮细胞在8周内可培养扩增到4202m2，足够进行泌尿系各种组织的修复替代[3]。Fossum等[4]收集患者膀胱冲洗液提取膀胱上皮细胞用于体外培养扩增，仍能形成正常形态的角化上皮层，从而开创了一种无创获取种子细胞的新途径。Lai等[5]获取患神经原性膀胱或膀胱外翻患者的膀胱后，将培养扩增的平滑肌细胞种植于聚乳酸和聚羟基乙酸共聚物(PLGA)上，免疫组化研究显示α肌动蛋白和肌球蛋白阳性，且在电刺激和拟胆碱药物作用下，出现明显的收缩舒张反应，说明其形态和功能特征与正常平滑肌细胞并无明显差异。这就进一步扩大了种子细胞的来源，也为临床应用奠定了基础。2006年Atala[2]首次报道了采用自体膀胱尿路上皮细胞和平滑肌细胞作为种子细胞构建组织工程化膀胱行膀胱扩大的临床研究，其种子细胞是通过耻骨上切开获取1-2cm2神经原性膀胱组织，行体外分离培养，培养6周后，细胞数量可达到7×108，可用于修复膀胱组织70-150cm2。

    然而，以上获取种子细胞的方法对泌尿系肿瘤患者并不适用。而采用具有自我更新和无限增殖能力的多能干细胞或成体干细胞诱导分化为种子细胞逐渐成为研究热点[6]。Rodriguez等[7]报道采用人脂肪源干细胞在一定条件下能诱导分化为结构功能正常的平滑肌细胞，诱导分化的平滑肌细胞表达膀胱平滑肌细胞的所有表面标志，包括平滑肌特异性α肌动蛋白、钙结合蛋白和重链肌球蛋白等，并且具有收缩舒张功能。Ottamasathien[8]最近研究表明胚胎干细胞能直接诱导分化为具有收缩舒张功能的平滑肌细胞。而采用干细胞体外诱导分化为尿路上皮细胞的研究尚未见报道。傅强等[9]分离培养兔包皮的表皮细胞作为种子细胞，种植于尿道无细胞基质上修复管状尿道缺损1.5cm，认为包皮表皮细胞能替代尿路上皮细胞修复尿道缺损。另外，Frimberger 等[10]采用人胚胎干细胞种植于猪小肠黏膜下层修复大鼠膀胱缺损，与单纯小肠黏膜下层修复比较，种植人胚胎干细胞的小肠黏膜下层能明显促进膀胱组织再生。进一步研究表明人胚胎干细胞具有趋化效益，能加快尿路上皮细胞和平滑肌细胞在支架上的爬行，加快膀胱组织再生[11]。

    2  支架材料的研究

    理想的支架材料应具有以下几点：①良好的组织相容性，无免疫原性，不发生排斥反应；②具有三维主体结构，以提供细胞黏附和生长的空间；③无毒性，适当的降解速率，降解产物应可吸收；④易塑型，有一定的强度对抗外力，并能调节细胞黏附、增殖、迁移和分化[12]。应用于泌尿系组织工程的生物支架分三大类：天然细胞外基质(ECM)如胶原、蛋白多糖、糖蛋白、网状纤维等；ECM衍生物如膀胱细胞外基质(BECM)、尿道细胞外基质(UECM)、小肠黏膜下层(SIS)等；合成聚合物如聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸(PLA)及两者的共聚物(PLGA)。上述三类材料的生物相容性，已通过这些材料与人尿路上皮细胞和平滑肌细胞共同培养所测试[13]。各种材料有各自的优缺点。高分子聚合材料能大规模生产，其机械性能、降解时间和微细结构可以很好地调控，但其生物相容性差。生物衍生材料是通过机械、化学方法除去组织中的细胞成分仅保留无细胞的细胞外基质，具有良好的组织相容性，可用于同种异体甚至异种移植，并不发生排斥反应。而且这类材料具有最接近人体的网架结构、生物力学性能、部分活性因子，有利于细胞黏附生长发挥生理功能，材料本身保留的某些成分(如黏附肽和生长因子)能促进组织再生，具有良好的促组织再生作用[14]。我们曾采用优化设计方案制备兔膀胱、尿道、血管细胞外基质，植入体内行兔膀胱扩大术和修复尿道缺损，其结果显示制备的细胞外基质具有良好的生物相容性和促组织再生能力[1516]。Kropp等[17]指出，并不是所有的SIS都具有相同的修复能力。即使同一个猪的不同肠段(如近段空肠和末段回肠)，其修复组织的结果也不同，只有用>3岁的母猪末段回肠制备SIS才具有稳定可靠的促组织再生能力。因此，今后研究方向包括筛选不同组织来源ECM衍生物，优化制备方法，以获得具有稳定可靠修复能力的ECM衍生物并形成产业化。

    3  泌尿及男生殖系组织工程化组织的构建

    3.1  尿道  目前，应用组织工程技术修复尿道缺损的方法有两种：一种为直接植入同种或异种细胞外基质(如BECM、UECM、SIS)，利用周围正常组织的再生能力沿着植入的ECM再生形成新的组织。这种方法以镶嵌补片修复部分尿道缺损已被一系列动物实验和临床研究所证实。Chen等[18]采用兔BECM以镶嵌补片方式修复兔尿道缺损，术后所有实验动物可通过新生尿道排空尿液；尿道造影显示尿道连续无狭窄；术后2周组织学检查见缺损处移行上皮细胞层已完全形成并有血管生长，术后6个月黏膜下肌纤维束已形成,证明BECM为尿道修复的良好材料。Kassaby等[19]应用尸体膀胱ECM修复33例尿道狭窄(成人28例，儿童5例)。将ECM修整与缺损面积同样大小，以镶嵌形式同周围尿道吻合形成新生尿道，修复长度2-16cm。观察术后患者排尿情况，并行逆行尿道造影、尿流率测定、膀胱尿道镜检等。随访4-7年除6例复发1例尿瘘外，其余均获治愈。Palmiteri等[20]报道采用猪小肠黏膜下层以镶嵌补片方法临床修复前尿道狭窄20例，狭窄长度平均为3cm(2-8cm)，16例球部狭窄患者均获得成功，但4例阴茎部狭窄患者中3例失败，长期随访中有7例患者发生轻度狭窄和尿流率下降。

    但上述方法并不适用于长段管状化尿道缺损的修复。Atala等报道单纯采用ECM修复管状化尿道缺损的长度一般都在1.0cm内，如果缺损过长或面积过大，单纯的无细胞基质修复易引起尿路狭窄和尿瘘。其原因可能是由于尿道的缺损过长，宿主的滋养血管延伸到缺损中心区域较为困难，缺乏血供的上皮细胞爬行能力减弱，难以覆盖整个创面。Filippo[21]报道在体外预先种植自体尿路上皮细胞和平滑肌细胞于生物支架上，构建组织工程化尿道后再植入体内替代修复尿道，可避免移植物收缩和狭窄发生，能形成结构和功能正常的新生尿道。最近，已有采用预先种植细胞的无细胞基质构建组织工程化尿道修复管状化尿道缺损的临床研究的报道[22]。

   3.2  膀胱  膀胱组织的再生相对较复杂，不仅需要多层尿路上皮覆盖，而且涉及到血管化、平滑肌和神经再生等问题。Oberpenning[23]对狗进行保留三角区的膀胱次全切除术，并采用预先种植尿路上皮和平滑肌细胞无细胞基质复合物(组织工程化膀胱)修复扩大膀胱。结果表明膀胱容量和顺应性分别为术前正常膀胱的95%和106%；组织学检查工程化膀胱组织形成了膀胱上皮层、黏膜下层、肌层三层结构。Zhang 等[24]切除22只狗90%的膀胱建立模型，术后1月分别采用单纯SIS或种植尿路上皮和平滑肌细胞的SIS(5cm×7cm)修复扩大膀胱，结果表明组织再生较差，扩大膀胱与周围组织黏连、萎缩和结石形成等。作者分析可能原因是缺乏血管化、膀胱次全切除后的炎症反应和瘢痕形成抑制组织再生。虽然SIS可用于组织修复，但到底采用多少层来修复替代还不清楚。另外最近研究显示一些商业公司制备的SIS体外抑制尿路上皮的生长[25]。Kanemastu等[26]用不同浓度的bFGF浸泡冻干的BECM形成生长因子支架复合物行膀胱扩大替代术，实验证实bFGF能显著增加修复部位的血管化和抑制移植物收缩，促进组织修复再生。最近研究表明添加神经生长因子和血管内皮生长因子也能促进组织再生[27]。2006年Atala领导的研究小组报道采用组织工程化膀胱扩大替代7例脊髓膜膨出患者的神经原性膀胱的临床研究。获取自体膀胱组织后体外分离培养尿路上皮和平滑肌细胞，种植到用胶原和聚乙醇酸等支架材料上，制成人造膀胱。术后随访近4 年,膀胱容量和顺应性等均有所改善，尤其是采用网膜包裹的组织工程化膀胱效果更好；患者术后肾脏功能正常，并无肠代膀胱所致的并发症发生；组织活检证实具有正常的尿路上皮、黏膜下层和肌层结构。最近的实验研究[28]表明，采用网膜包裹组织工程化膀胱作为一种体内孵化器能为工程化组织提供有效血供，促进组织再生和抑制移植物纤维化，通过3周的孵化，形成的组织工程化膀胱由多层尿路上皮、平滑肌以及血管构成的活性组织，并且具有收缩舒张功能。这种首先在体内孵化一段时间先形成有血管活性的膀胱组织,再用于膀胱修补替代的方法将为以后的临床应用提供新的思路。

    3.3  阴茎海绵体组织工程  阴茎海绵体平滑肌是阴茎勃起功能的基础。Park等[29]报告将人阴茎海绵体平滑肌细胞和人内皮细胞(ECV 304)，分别接种于生物可降解聚合体上并植入裸鼠皮下，结果阴茎海绵体平滑肌细胞和内皮细胞均可在聚合体上生长并形成多层平滑肌和内皮细胞，经检测α肌动蛋白染色和VIII因子抗体阳性。Falke等[30]采用阴茎海绵体的天然细胞外基质为支架，将人阴茎海绵体平滑肌细胞和内皮细胞逐层种植在无细胞基质支架上并移植到裸鼠皮下，1周后见新生毛细血管长入海绵体无细胞基质中；2周后可见到血状窦壁上平滑肌细胞和内皮细胞组织显著增加；4周后整个支架已全部被细胞结构覆盖且具有海绵体的组织结构。Kwon等[31]采用兔阴茎海绵体无细胞基质为支架，分离培养扩增海绵体平滑肌细胞和内皮细胞并接种到该支架上，横断切除实验兔长度为0.7cm部分阴茎(但不损伤尿道海绵体)，并将上述细胞支架复合物以插入的方式移植到切断阴茎的断面处修复阴茎海绵体缺损。术后3月、6月取出移植物观察显示：海绵体无细胞基质维持了其结构完整性，有多层内皮细胞和平滑肌细胞长入，Westernblot检测具有合成eNOS和nNOS的能力。阴茎海绵体造影显影十分完好，实验兔具有正常的勃起功能并能完成交配并使雌兔受孕。

    3.4  组织工程在泌尿外科其他方面的应用  将组织工程和干细胞技术结合是治疗压力性尿失禁的有效方法。目前压力性尿失禁的非手术治疗主要包括在内窥镜下经尿道注射填充性材料到尿道周围组织，压迫尿道使其阻力增加而达到治疗目的。但该方法远期效果并不理想，而且注射外源性材料易导致慢性炎症反应、尿道周围脓肿、下尿路梗阻等并发症[32]。近年来采用自体干细胞注射可以重建下尿道，恢复尿道括约肌正常的形态结构，从而获得功能重建[33]。最近，Strasser等[34]报道了对63例压力性尿失禁的女性患者分别进行超声引导下自体肌源性干细胞注射或内镜下注射胶原的临床研究。随访12个月，结果显示获得干细胞注射的42例患者中38例得到治愈，能得到完全控尿；超声检查示尿道括约肌明显增厚，括约肌收缩明显增强；未见明显副作用发生。而21例采用传统内镜下注射胶原的患者仅有2例治愈。该治疗方法有望成为女性压力性尿失禁的标准治疗方法。

    4  前景和展望

    泌尿外科组织工程技术研究经过近20年的努力，已取得了十分显著的成绩。近年来将干细胞研究引入到泌尿外科组织构建中必将为泌尿外科组织工程的种子细胞提供更广阔的来源，尤其是为泌尿系肿瘤或器官衰竭患者提供种子细胞。目前泌尿外科组织工程技术正处于从基础研究向临床应用转化的关键阶段，深入研究组织工程化组织血管化、器官保存以及种子细胞和支架材料的产业化等问题将为泌尿外科组织工程化组织的临床应用奠定坚实的基础。

【参考文献】
  [1]Atala A. Tissue engineering and regenerative medicine: concepts for clinical application [J]. Rejuvenation Res, 2004, 7:1531.

[2]Atala A, Bauer SB, Soker S, et al. Tissueengineered autologous bladders for patients needing cystoplasty [J]. Lancet, 2006, 367:12411246.

[3]Cilento BG, Freeman MR, Schneck FX, et al. Phenotypic and cytogenetic characterization of human bladder urothelia expanded in vitro [J]. J Urol, 1994, 152:655.

[4]Magdalena F, Carljohan G, Agneta N, et al. Isolation and in vitro cultivation of human urothelial cells from bladder washings of adult patients and children [J]. Scand J Plast Reconstru Surg Hand Surg, 2003, 37:4145.

[5]Lai JY, Yoon CY, Yoo JJ, et al. Phenotypic and functional characterization of in vivo issue engineering smooth muscle from normal and pathological bladders [J]. J Urol, 2002,169:18531858.

[6]Becker C, Jakse G. Stem cells for regeneration of urology structures [J]. Eur Urol, 2007, 51:12171228.

[7]Rodriguez LV, Alfonso Z, Zhang R, et al. Clonogenic multipotent stem cells in human adipose tissue differentiate into functional smooth muscle cells [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103(32):1216712172.

[8]Ottamasathien S, Wang Y, Williams K, et al. Directed differentiation of embryonic stem cells into bladder tissue [J]. Dev Biol, 2007, 304:556566.

[9]Fu Q, Deng CL, Liu W, et al. Urethral replacement using epidermal cellseeded tubular acellular bladder collagen matrix [J]. BJU Int, 2007, 99(5):11621165.

[10]Frimberger D, Morales N, Shamblott M, et al. Human embryoid bodyderived stem cells in bladder regeneration using rodent model [J]. Urology, 2005, 65(4):827832.

[11]Frimberger D, Morales N, Gearhart JD, et al. Human embryoid bodyderived stem cells in tissue engineeringenhanced migration in coculture with bladder smooth muscle and urothelium [J]. Urology, 2006, 67(6):12981303.

[12]Brehmer B, Rohrmann D, Becker C, et al. Different types of scaffolds for reconstruction of the urinary tract by tissue engineering [J]. Urol Int, 2007, 78(1):2329.

[13]Pariente JL, Kim BS, Atala A. In vitro Biocompatibility evaluation of naturallyderived and synthetic biomaterials using normal human bladder smooth muscle [J]. J Urol, 2002, 167:18671871.

[14]Badylak SF. Xenogeneic extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction [J]. Transpl Immunol, 2004, 12:367377.

[15]Yang SX, Shen FJ, Hu YF, et al. Experimental bladder defect in rabbit repaired with homologous bladder extracellular matrix graft [J]. Chin Med J, 2005, 118:957960.

[16]Yang SX, Yao Y, Hu YF, et al. Reconstruction of rabbit urethra using urethral extracellular matrix [J]. Chin Med J, 2004, 117:17861790.

[17]Kropp BP, Cheng EY, Lin HK, et al. Reliable and reproducible bladder regeneration using unseeded distal small intestinal submucosa [J]. J Urol, 2004, 172: 1710 1713.

[18]Kimuli M, Eardley I, Southgate J. In vitro assessment of decellularized porcine dermis as a matrix for urinary tract reconstruction [J]. BJU int, 2004, 94:859866.

[19]Chen F, Yoo JJ, Atala A. Acellular collagen matrix as a possible off the shelf biomaterial for urethral repair [J]. Urology, 1999, 54: 407410.

[20]Palminteri E, Berdondini E, Colombo F, et al. Small intestinal submucosa (SIS) graft urethroplasty: shortterm results [J]. Eur Urol, 2007, 51:16951701.

[21]De Filippo RE, Yoo JJ, Atala A. Urethral replacement using cell seeded tabularized collagen matrices [J]. J Urol, 2002, 168:17891793.

[22]Orabi HO, Aboushwareb TA, Zhang YY, et al. Tissue engineered tubularized urethra for surgical reconstruction: a preclinical study [J]. J Urol Suppl, 2007, 177:197

[23]Oberpenining FO, Meng J, Yoo J, et al. De novo reconstitution of a functional urinary bladder by tissue engineering [J]. Nat Biotechnol, 1999, 17:25.

[24]Zhang Y, Frimberger D, Cheng EY, et al. Challenges in a larger bladder replacement with cellseeded and unseeded small intestinal submucosa grafts in a subtotal cystectomy model [J]. BJU Int, 2006, 98(5):11001105.

[25]Feil G, ChristAdler M, Maurer S, et al. Investigations of urothelial cells seeded on commercially available small intestine submucosa [J]. Eur Urol, 2006, 50:13301337.

[26]Kanematsu A, Yamamoto S, Noguchi T, et al. Bladder regeneration by bladder acellular matrix combined with sustained release of exogenous growth factor [J]. J Urol, 2003, 170:16631638.

[27]Kikuno N, Kawamoto K, Hirata H, et al. Nerve growth factor (NGF) combined with vascular endothelial growth factor (VEGF) can enhance angiogenesis, neurogenesis,and muscular regeneration accompanied with functional activity of the bladder augmented with acellular matrix graft [J]. J Urol Suppl, 2007, 177:140141.

[28]Baumert H, Simon P, Hekmati M, et al. Development of a seeded scaffold in the great omentum: feasibility of an in vivo bioreactor for bladder tissue engineering [J]. Eur Urol, 2007, 52(3):884890.

[29]Park HJ, Yoo JJ, Kershen RT, et al. Reconstitution of human corporal smooth muscle and endothelial cells in vivo [J]. J Urol, 1999, 162:11061109.

[30]Falke G, Yoo JJ, Machado MG, et al. Formation of corporal tissue architecture in vivo using human cavernosal muscle and endothelial cells seeded on collagen matrices [J]. Tissue Eng, 2003, 9:871879.

[31]Kwon TG, Yoo JJ, Atala A. Autologous penile corpora cavernosa replacement using tissue engineering techniques [J]. J Urol, 2002, 168:17541758.

[32]Furuta A, Jankowski RJ, Pruchnic R, et al. The promise of stem cell therapy to restore urethral sphincter function [J]. Curr Urol Rep, 2007, 8(5):373378.

[33]Mitterberger M, Pinggera GM, Marksteiner R, et al. Adult stem cell therapy of female stress urinary incontinence [J]. Eur Urol, 2008, 53(1):169175.

[34]Strasser H, Marksteiner R, Margreiter E, et al. Autologous myoblasts and fibroblasts versus collagen for treatment of stress urinary incontinence in women: a randomised controlled trial [J]. Lancet, 2007, 369(9580):21792186.

作者单位：(武汉大学人民医院泌尿外科，武汉 430060)关键词：组织工程；泌尿外科；微创修复