糖尿病大鼠膀胱和脊髓背根神经节中P75的表达与尿流动力学改变

【摘要】  　　目的 探讨糖尿病大鼠膀胱与脊髓背根神经节(DRG)中神经生长因子受体P75的表达及尿流动力学改变。方法 建立糖尿病大鼠模型20只，以15只正常大鼠为对照，应用免疫组化方法，分别检测大鼠膀胱组织及DRG中P75的变化情况，结合尿流动力学改变，探讨糖尿病膀胱病变(DC)可能的发病机制。结果 与对照组比较，糖尿病组膀胱湿重增加[(171.150±6.081) vs. (135.530±5.330)mg]，最大膀胱容量增加[(2.97±0.54)mL vs. (1.73±0.23)mL]，储尿期膀胱压降低[(0.39±0.05) vs. (0.77±0.06)kPa]，最大膀胱压力降低[(2.98±0.12) vs. (5.99±0.25)kPa] (P均<0.05)。无论是在膀胱组织还是在DRG中，糖尿病组P75的表达均低于对照组，有统计学意义(P<0.05)。结论 神经生长因子的受体P75在膀胱与脊髓背根神经节中的异常表达可能与DC的发病机制有关。

【关键词】  糖尿病膀胱病变 背根神经节 P75受体 尿流动力学

　　Expression of P75 in lumbar dorsal root ganglia and bladder of diabetic rats and urodynamic changes

　　Li Yuefeng1, Guo Yuexian2, Gao Jingyu2

　　(1. Department of Urology, the First Hospital of Handan City, Handan 056000; 2. Department of Urology, the Third Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, China)ABSTRACT: Objective  To investigate the expression of P75 in lumbar dorsal root ganglia (DRG) and bladder of diabetic rats and the urodynamic changes. Methods  20 diabetes model of rats were built, with 15 normal rats as control. Expression of P75 in bladder and DRG was measured by immunohistochemical staining and urodynamic changes were measured. Results  Compared with the control group, in the diabetic group, bladder wet weight increased [(171.150±6.081) vs. (135.530±5.330)mg], the maximum bladder capacity increased [(2.97±0.54) vs. (1.73±0.23)mL], filling pressure of bladder decreased [(0.39±0.05) vs. (0.77±0.06)kPa], and the maximum bladder pressure decreased [(2.98±0.12) vs. (5.99±0.25)kPa] (P<0.05), expression of P75 decreased both in bladder wall (t=-2.589, P=0.010) and in DRG (t=-2.599,  P=0.009). Conclusion  Reduction of P75 in bladder and DRG may be associated with the pathogenesis of diabetic cystopathy (DC).

　　KEY WORDS: diabetic cystopathy; dorsal root ganglion; P75; urodynamic

　　糖尿病膀胱病变(DC)是糖尿病的常见并发症，是糖尿病周围神经病变在膀胱的表现。神经生长因子(NGF)及其受体的改变是糖尿病神经病变的主要发病机制之一。本实验通过对靶器官和脊髓背根神经元的NGF受体P75水平的研究，结合尿流动力学改变，进一步阐明NGF及其受体参与DC形成的机制，说明P75在糖尿病膀胱病变发生发展中可能起到的作用。

　　1  材料与方法

　　1.1  动物分组  35只SpragueDawley(SD)健康雌性大鼠，由河北医科大学实验动物中心提供，体重200～250g，普通饮食喂养。随机分成2组：对照组15只，糖尿病组20只。

　　1.2  实验试剂  链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)由美国Sigma公司生产，批号：112K1006；血糖测定仪与血糖试纸为美国强生公司产品；免疫组化试剂购自北京中山生物技术有限公司。

　　1.3  模型制备  大鼠禁食12h，糖尿病组大鼠按STZ 60mg/kg体重进行单次腹腔注射，对照组腹腔注射等体积的枸椽酸缓冲液。注射STZ 72h后测空腹尾静脉血葡萄糖浓度(blood glucose, BG)。BG>16.7mmol/L为模型成功。

　　1.4  尿动力学测定及检测P75的表达  大鼠饲养8周后，测血糖，称体重，测代谢笼24h尿量。麻醉(50g/L水合氯醛腹腔注射，1.2mL/kg)，仰卧位固定，打开腹腔，于膀胱颈部下方切开尿道，插入F2测压导管至膀胱，以0.5mL/min行生理盐水膀胱灌注，测储尿期膀胱压、最大膀胱容量、最大膀胱压力等参数。尿动力学测定后，取下腹部正中切口，切取完整膀胱测量湿重。将大鼠俯卧于冰板上，于脊柱两侧取两侧腰6骶1 DRG，标本立即放入固定液中。采用SP免疫组织化学染色法，膀胱逼尿肌细胞内或DRG神经元内含有棕黄色颗粒为阳性。每张切片在高倍镜下选择8～10个视野并计数100个细胞。判断标准：阳性细胞数<10%为阴性表达(-)，≥10%、<30%为弱阳性表达(+)，≥30%、<60%为中度阳性表达()，≥60%为强阳性表达()。

　　1.5  统计学处理  采用SPSS 13.0系统软件进行t检验及等级资料秩和检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2  结    果

　　2.1  大鼠的一般情况与尿动力学改变  大鼠腹腔注射STZ 72h后，血糖已经升高。8周时，与对照组(n=15)比较，糖尿病组(n=20)的血糖明显升高[(30.900±3.294)mmol/L vs. (4.787±0.297)mmol/L]，体重明显下降[(248.050±15.517)g vs. (322.800±15.920)g]，代谢笼24h尿量明显增加[(88.310±7.222)mL vs. (20.927±2.900)mL]，膀胱湿重明显增加[(171.150±6.081)mg vs. (135.530±5.330)mg]，最大膀胱容量明显增加[(2.97±0.54)mL vs. (1.73±0.23)mL]，储尿期膀胱压明显降低[(0.39±0.05)kPa vs. (0.77±0.06)kPa]，最大膀胱压力明显降低[(2.98±0.12)kPa vs. (5.99±0.25)kPa]。两组比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。

　　2.2  P75在膀胱壁与背根神经节的表达  P75在膀胱壁黏膜下、固有膜和逼尿肌细胞内均有分布，和对照组(n=15)相比，糖尿病组(n=20)表达明显减少(图1)(t=-2.589, P=0.010, vs. control)。P75在背根神经节主要分布在细胞浆内，和对照组(n=15)相比，糖尿病组(n=20)表达明显减少(图2)(t=-2.599, P=0.009, vs. control)，见表1。 表1  P75在膀胱和腰骶背根神经节的表达

　　3  讨    论

　　3.1  关于糖尿病模型制作  STZ是从无色链霉菌经培养、生长后提取出的一种广谱抗生素，大鼠糖尿病模型的制备多采用STZ诱导。本实验采用腹腔注射，易操作、准确、快速。通过检测血糖、体重和代谢笼24h尿量，说明单次腹腔注射能成功诱导糖尿病大鼠模型建立，为糖尿病实验研究提供了一种适用的动物模型。

　　3.2  尿流动力学变化  本实验发现糖尿病组大鼠膀胱湿重和最大膀胱容量明显增加，储尿期膀胱压力和最大膀胱压力则明显降低，提示逼尿肌功能损害，也从功能方面证实了DC模型的形成。本实验结果与临床上糖尿病膀胱病变中晚期患者尿流动力学改变相一致。临床上本病既可以表现为膀胱舒张功能下降，出现临床所见的低顺应性膀胱，又可以出现逼尿肌收缩受损，表现为逼尿肌最大收缩力和持续收缩力下降，甚至无排尿异常也有尿流动力学异常改变[1]。

　　3.3  关于糖尿病膀胱病变  DC的病变主要表现在逼尿肌和神经，NGF水平的改变是糖尿病神经病变的主要发病机制之一[2]。NGF 由神经元靶组织产生，被神经元的轴突末梢摄取，逆行运输到胞体，为这些神经元的存活和维持所必需。膀胱产生NGF减少和(或)转运到DRG 的NGF不足是糖尿病膀胱病的重要病因之一。

　　NGF有两种受体，即低亲和力的P75型NGF受体(P75)和高亲和力的酪氨酸激酶受体TrkA[3]。神经生长因子就是通过这两种受体的介导而发挥其生物学功能[4]。在无TrkA受体存在时，P75可调控细胞的死亡。NGF与P75结合后，可激活促进凋亡的转录因子NFkβ，也可引起鞘磷脂水解成神经酰胺，提高cJun氨基末端激酶(JUN)的活力，最终导致细胞凋亡[5]。在我们的实验中，无论是在DRG还是在膀胱组织，和正常组相比，糖尿病组P75表达明显减少。按照上述观点，P75减少，其介导的细胞凋亡的作用就会减少，表明在糖尿病膀胱中有神经再生的现象。

　　在TrkA受体存在时，P75参与高亲和位点的形成，增加NGF与高亲和力受体TrkA的亲和力。P75可以作为一种副因子调整TrkA受体对NGF的反应，有利于TrkA与NGF的结合[5]。P75能与NGF受体起明显的功能性相互作用，能允许TrkA受体对较低浓度的NGF起反应。由于体内NGF的量很有限，P75这种加强功能可起一定的重要作用。既然P75可以增加高亲和力受体TrkA与NGF的结合力，参与神经生长因子NGF的逆行运输，这就不难解释作为靶器官的膀胱组织中P75表达减少，同时DRG中NGF相应减少。P75最终可以通过降低DRG中NGF的含量在糖尿病膀胱病变的发生中起作用。

【参考文献】
  [1]Apfel SC. Neurotrophic factors and diabetic peripheral neuropathy [J]. Eur Neurol, 1999, 41(2):2735.

[2]Sasaki K, Chancellor MB, Goins WF, et al. Gene therapy using replicationdefective heroes simplex virus vectors expressing nerve growth factor in a rat model of diabetic cystopathy [J]. Diabetes, 2004, 53(10):27232730.

[3]Goss JR, Goins WF, Lacomis D, et al. Herpes simplexmediated gene transfer of nerve growth factor protects against peripheral neuropathy in streptozotocininduced diabetes in the mouse [J]. Diabetes, 2002, 51(7):22272233.

[4]Stephen RJ, Salton MD. Neurotrophins,growthfactorregulated gene and the control of energy balance [J]. Mt Sinai J Med, 2003, 70(3):93100.

[5]Kliment P, Gatzinsky, Rosaria P, et al. P75 and Trka receptors are both required for uptake of in adult sympathetic neurons:use of novel fluorescent NGF conjugate [J]. Br Res, 2001 (920):226238.(编辑 王玮)

作者单位：1. 河北省邯郸市第一医院泌尿外科，河北邯郸 056002；2. 河北医科大学第三医院泌尿外科，河北石家庄 050000